发酵工程实验指导书2012
发酵工程实验指导书辽宁石油化工大学环境与生物工程学院主编《发酵工程》实验指导书实验学时：24学时适用专业：生物工程生物技术是当前优先发展的高新技术之一，本课程是为了和生物工程专业理论教学相配合，通过实践教学，培养学生对生物工程专业知识的具体实际应用的能力。
发酵工程实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学生学习了《生物化学及实验》、《微生物学及实验》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的，课程目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个微生物生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。
通过学习，使学生能掌握发酵工程常用的实验方法和常见的发酵工程设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。
本实验指导书包括：实验一、细菌增殖曲线的测定（6学时）实验二、土壤中放线菌的分离与纯化（6学时）实验三、发酵菌株的初筛实验四、枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育（6学时）（必做）实验五、淀粉酶的固态发酵（6学时）实验六、发酵过程中糖的利用（6学时）实验七、玉米淀粉液化和糖化（6学时）实验八、淀粉酶的固定化生产（6学时）实验九、摇床培养确定酵母菌体的培养和营养条件（6学时）（必做）实验十、小型连续发酵实验（6学时）实验十一、甜酒酿的制作（6学时）备注：实验一至实验七为基础实验，实验八至实验十一为设计性和综合性实验，除必做实验外，其他可选做。
实验总时间为24学时，包括设计实验、准备实验、进行实验、书写实验预习及最终报告及所需仪器药品清单等。
实验一发酵菌株的初筛一、实验目的与要求目的：1、从已分离到的细菌或真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。
2、学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。
要求：1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
蛋白酶也是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。
根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。
产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。
本实验以淀粉酶或蛋白酶产生菌株的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选方法。
三、实验主要仪器设备及材料1.菌株：自然界中分离到的目的菌株2.淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.2%。
琼脂2%，pH 7.2-7.4。
3.蛋白酶产生菌筛选培养基：葡萄糖0.05,氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.05%，磷酸二氢钾0.05%，酪蛋白1%，琼脂2%，pH 7.5。
4.器材：培养皿、吸管、250ml三角瓶、无菌水（含灭菌玻璃珠）、标签纸、三氯乙酸、碘液、玻璃刮铲、吸管、电炉、天平等。
四、实验方法、操作步骤1、配制淀粉酶或蛋白酶的筛选培养基，分别装于三角瓶中，121摄氏度灭菌30分钟，冷却至60摄氏度时倒平板，每皿约20毫升。
2、配制指示菌菌悬液，以无菌操作法挑取3环细菌或酵母指示菌菌苔装到有3ml无菌水的试管中，制成菌悬液，吸取0.1ml涂布在相应培养基的平板上。
注意：用淀粉酶产生菌筛选培养基来分离产生淀粉酶的细菌，将分离纯化的菌株点种于淀粉培养基平板上，每皿点种5点。
3、将平板放在培养箱中培养1-2天，观察菌落的生长情况。
4、淀粉酶产生菌培养基上形成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满平皿为度，如果菌落周围有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产淀粉酶，透明圈与菌落直径之比越大，说明产淀粉酶活力越强。
5、蛋白酶产生菌培养基上形成菌落后，可在平板上滴加2.5%三氯乙酸溶液，以刚铺满平皿为度，菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌产蛋白酶。
五、试验报告记载要求1、姓名、班级、学号、试验开始日期/时间等。
2、实验的设计方案、所用的仪器名称、药品名称及重量；所使用的样品名称、来源。
3、试验操作步骤记载。
4、实验条件记载（温度、浓度、仪器条件等）。
5、实验分析。
6、实验中应注意的问题/收获。
六、思考题查阅资料，设计一个实验来筛选脂肪酶或其他酶的产生菌。
实验二枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育一、实验目的与要求目的：通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
要求：1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容物理诱变因子以紫外线辐射的使用最为普遍，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。
在紫外线的波长在200-380nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253-265cm,一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。
紫外线诱变得主要生物学效应是由于DNA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中嘧啶更为敏感。
它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA结构变化的形式很多，但其最主要的作用是引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），阻碍碱基间的正常配对，从而微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
三、实验主要仪器设备和材料菌种：枯草芽孢杆菌；器皿：紫外线灯（15W）；试管、锥形瓶、移液管、玻璃珠、培养皿；培养基及药品：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、NaCL、水、碘液。
四、实验方法、操作步骤1、菌悬液的制备：取培养48小时的活化枯草芽孢杆菌的斜面1—2支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并入盛有灭菌玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡10分钟，以打碎菌块。
菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-8稀释液。
2、平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3、紫外线处理：（1）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
(2) 取直径6cm无菌平皿9套，涂平板取10-6、10-7、10-8三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
(3) 将盛有菌悬液的平皿置于紫外线灯下分别搅拌照射0分钟、3分钟及5分钟。
4、培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
5、计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理3分钟、5分钟、7分钟后的存活细胞数及其存活/致死率。
6、观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。
与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。
并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。
此斜面可作复筛用。
五、实验结果将实验结果填入下表六、试验报告记载要求1、姓名、班级、学号、试验开始日期/时间等。
2、实验的设计方案、所用的仪器名称、药品名称及重量；所使用的样品名称、来源。
3、试验操作步骤记载。
4、实验条件记载（温度、浓度、仪器条件等）。
5、实验分析。
6、实验中应注意的问题/收获。
七、思考题1、用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？2、经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三发酵过程中糖的利用一、实验目的与要求目的：1、了解发酵过程中碳源的利用规律。
2、掌握用DNS法测定还原糖的含量的方法。
要求：1、复习发酵工程中所学到的糖质原料的种类、发酵过程中糖的转化等过程，了解影响糖利用的各种因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理糖类是微生物生命活动中主要的碳源和能源物质。
一方面微生物的生长需要糖类，另一方面，糖也构成了代谢产物中碳架的主题所以在发酵过程中，糖的消耗是一项重要的生理指标，是判断发酵进程的主要依据。
将少量微生物接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的还原糖含量，以还原糖含量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制出的曲线可以反映微生物在一定环境条件下所表现出的生长规律。
因此通过测定微生物的碳源利用规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定还原糖含量有多种不同的方法，如斐林试剂法、蒽酮比色法、3，5二硝基水杨酸法（DNS法）等。
它们各有优缺点。
本实验采用的是DNS法。
DNS法是利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后，被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度呈一定比例关系这一原理而设计的，可用于比色测定。
操作简便、快速、杂质干扰较少。
三、实验主要仪器设备及材料天平、分光光度计，比色杯，恒温摇床，灭菌锅、移液管，试管，三角瓶、滤纸、比色管菌种：黑曲霉培养基：黑曲霉斜面培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，加水至1000mL。
发酵培养基：葡萄糖15%，硫酸铵0.3%。
试剂：标准葡萄糖溶液：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，再定容到刻度，摇匀，浓度为1mg/mL。
3,5-二硝基水杨酸试剂配制甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300mL10%氢氧化钠溶液中，再加入880mL 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。
发酵工程技术验指导书
发酵工程技术实验指导书适用课程：发酵工程技术目录发酵工程技术实验指导书 (1)实验一酵母菌的分离和纯化 (1)实验二果酒制作及酒精度测定 (4)实验三乳酸菌的分离和辨别 (8)实验四酸奶制作和感官鉴评 (13)实验五土壤中产醋酸菌种的分离挑选 (16)实验六发酵型虾酱的生产实验及氨基酸态氮的测定 (19)实验一酵母菌的分离和纯化一、实验目的应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的大体方式。
二、实验原理大多数酵母菌为腐生，其生长最适pH为4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例若是园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速，易于分离培育，在液体培育基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常常利用酸性液体培育基取得酵母菌的培育液，然后在固体培育基上用划线法分离纯化。
三、实验材料及试剂1、成熟葡萄或苹果等果皮2、马铃薯葡萄糖琼脂培育基：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。
配制方式：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200 g并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。
（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培育基，补足水分。
（3）在115℃条件下高压灭菌20分种。
3、乳酸马铃薯葡萄糖培育液：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。
4、0.1%美蓝染液：0.1g美蓝溶于100mL蒸馏水中。
5、生理盐水四、主要仪器设备高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培育箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml的无菌吸管、18*180mm试管、培育皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。
发酵工程实验指导.第2版
发酵工程实验指导.第2版
发酵工程实验指导是一本专门介绍发酵工程实验的书籍，共分为5部分。
第一部分介绍了发酵工程实验基础知识，包括发酵原理、发酵过程控制、微生物文献检索和实验室设备等内容；
第二部分介绍了发酵工程实验的常用方法，包括细胞计数、测定代谢产物、电导率和pH检测、抗菌素耐药性测定、转录调控因子的表达分析、剂量-反应曲线测定和微生物的培养等；
第三部分介绍了发酵工程中的关键变量，包括培养基、温度、pH值、抗原浓度、速率和加料技术等；
第四部分介绍了发酵工程实验中的数学模型，包括模拟技术、统计分析和多元线性回归分析等；
第五部分介绍了发酵工程中的实际应用，包括食品发酵、酿酒发酵、非食品发酵、生物反应器和活性成分的分离等。
发酵工艺综合实习指导书
发酵工程综合实验指导讲义综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定一土壤中稀有放线菌的分离和纯化1 实验目的了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。
2 实验原理筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。
放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。
一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。
若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。
然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。
由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。
3 仪器和材料（1）培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。
（2）灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。
（3）其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。
4 试验步骤（1）采土：选择适宜采样地点。
用采土铲去除表土，取5～10cm深处的土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。
（2）土样预处理：新鲜土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育的影响。
（3）制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右的各培养基，分别倒入平皿，每皿约15～20ml。
发酵工程大试验(2012)
发酵罐 、蒸汽发生器进水龙头
发酵罐电源、电机开关及下位机
发酵罐的控制及使用：通过下位机进行
1、通过下位机“登陆系统”。
2、输入密码后，点击“确认”。操作员“100”，低级权限。
3、发酵罐在准备发酵或者灭菌时都必须先点击“系统控制”的 “启动”。
6.发酵时，上位机只能监控及输出数据，用下位机设置参数。两者关系，下位机优 先。
2.空消前打开蒸汽发生器、空压机，将pH、DO电极拔出，用堵帽螺丝塞住并拧紧。 其余盖板螺丝、补料口螺丝须全部拧紧。发酵罐视镜窗口装上防护板。
3.空消前须将夹套中的水排空（？），发酵罐装入约5L水（将温度电极探头淹过即 可）。
4.开启发酵罐电源，登陆系统，点击“启动”，进入灭菌控制→灭菌参数设定。
空罐灭菌转速设定0rpm 搅拌停止温度设定0℃ 灭菌稳定温度设定121℃ 灭菌时间设定10～30min，一般为20min 灭菌完成罐压设定为0.05MPa 灭菌完成后温度设定37℃ 灭菌完成后流量设定30.0L/min 点击“开始”，即可自动根据灭菌参数来灭菌。
发酵工程大实验（2）
湖南大学生发酵方式 三、发酵罐操作
录
四、蒸汽发生器
五、空气压缩机 六、空罐灭菌（空消）
七、实际装料灭菌（实消）
八、发酵培养 九、溶氧（DO）与转速的关联
十、发酵罐工作组织流程
十一、思考题
一、 发酵设备
灭菌系统：蒸汽发生器
发酵罐自带 电加热 自来水冷却
温控系统
蒸汽发生器：灭菌消毒时用 冷水机：控温低于水温时用
发酵设备
发酵系统：发酵罐
空气动力系统：空压机。提供罐压、氧气、气动阀 动力
发酵罐
冷水机及蒸汽发生器
空压机
发酵工程技术实验指导书
发酵工程技术实验指导书用课程：酵工程技术目录实验一酵母菌的分离和纯化 (1)实验二果酒制作及酒精度测定 (3)实验三乳酸菌的分离和鉴别 (6)实验四酸奶制作以及感官鉴评 (9)实验五土壤中产醋酸菌种的分离筛选 (11)实验六发酵型虾酱的生产实验及氨基酸态氮的测定 (13)实验一酵母菌的分离和纯化一、实验目的用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理多数酵母菌为腐生，其生长最适pH为4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。
三、实验材料及试剂1、成熟葡萄或苹果等果皮2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。
配制方法：1）先将马铃薯去皮，切片，称200 g并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。
（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。
（3）在115℃条件下高压灭菌20分种。
3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。
4、0.1%美蓝染液：0.1g美蓝溶于100mL蒸馏水中。
5、生理盐水四、主要仪器设备压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml的无菌吸管、18*180mm试管、培养皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。
五、实验方法l、接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装100mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分搅拌后，用无菌移液管吸取1mL接入到9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置28～30℃，培养24小时。
(整理)发酵工程实验技术实验指导(学生版)
发酵工程实验技术实验指导贵州大学生命科学学院二零壹叁年叁月目录目录 (1)实验一小型发酵罐的构造 (2)实验二枯草杆菌的发酵生产 (6)实验三抗生素的检测 (13)实验一 L1523型小型发酵罐的构造一、实验目的熟悉小型发酵罐的构造，了解发酵罐各种构造的功能。
二、小型发酵罐的构造小型发酵罐是实验室进行小规模试验研究的必备装置，图1所示为瑞士比欧生物工程公司生产的L1523型小型发酵罐、主要由罐体、通气系统、搅拌系统、加热及控温系统、监测及控制系统等几个部分组成。
图1 L1523型发酵罐的外观排气管空气过滤器安全阀 压力表 罐盖 玻璃罐体挡板 空气 进气管 搅拌器及搅拌电机加热器蠕动泵 溶氧 控制器pH 控制器温度 控制器 发酵罐 电源开关搅拌器转速控制器空气 过滤器 热循环泵图2 罐体外观图3 罐体（vessel）图4 罐盖（lid）图5 罐底（bottom）图6 搅拌器（disc turbine）图7 防护罩（safety jacket）图8加热器和直流电机（heater and AC motor）图9 空压机（air compressor）图10 安全阀（safety valve）1.罐体罐体是发酵生产微生物菌体或代谢产物的场所，一般由不锈钢、陶瓷或特种玻璃制成，其体积根据需要可从0.1升到100升不等。
L1523型发酵罐的体积为19升，发酵罐的外形参见图2，由罐盖（图4）、罐体（图3）和罐底（图5）组成。
（1）罐盖：由耐腐蚀的不锈钢构成，其上有十二个圆孔，分别用于安装pH 探头、温度探头、溶解氧探头、气压表、调节pH的补酸、补碱管、排气管过滤器、通气管、放样管和安全阀（图10），靠近外侧的两个孔一般用塞子塞住，主要用于接种、加消泡剂等。
（2）罐体：由耐高温、高压的特种玻璃制成，其内有各种探头、通气管、放样管、搅拌器（图6）和挡板等。
（3）罐底：由具夹层的不锈钢制成，夹层内与加热器和冷却水联通，通过此夹层与发酵罐进行热交换，以控制罐内温度。
孙中贯--发酵工程实验教案 - 2012级
葡萄糖（6.5g）、酵母膏（10g）、尿素8（分消）、 K2HPO4（0.35g）、MgSO4（0.2g）、pH 7.0-7.2、32℃ 2.4.3 发酵培养基
葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母膏2% 3器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、分光光度计、恒温培养箱、酒精计 四实验步骤 1生长曲线的测定
（1） 配制培养基，250mL三角瓶装100mL培养基，一共28瓶， 0.1MPa灭菌20min，备用；
（2） 菌种活化：活性干酵母1g，100mL2%的蔗糖溶液中 (35~38℃),摇匀，置于30~32 ℃恒温箱中活化1~2h，即得1% 的ADY活化液。
测定微生物的数量有多种方法，如血球计数法、平板活菌计数法、 称重法、比浊法等，本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸 光度(A) 成正比也称光密度比浊法，只要用分光光度计测得菌液的A后 与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线，此法快捷、简 便。
产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。工业发酵的目的是 为了收获产物，因此必须搞清产物积累最高时所需的发酵时间。如果提 前终止发酵，营养物质还没有完全被利用，发酵液中的产物量偏低；如 果发酵时间过长，一方面产物可能会分解，另一方面也降低了设备利用 率。因此，学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重 要的指导意义。 三实验器材 1菌种 酿酒酵母 2培养基
1 前言 近几年来，采用谷氨酸生物素缺陷型菌种来生产谷氨酸已经不能达
到人需要的那种效果，所以很多味精公司、生物研究所等都在致力于开 发新的耗糖少，产酸多，产酸稳定的菌种。为此，很多研究者做了很多 实验，有些是有些成就的。发酵新工艺采用的是温度敏感型菌种，温度 敏感型谷氨酸菌多为基因突变型菌株，突变位置是发生在决定与谷氨酸 分泌有关系的细胞膜结构的基因上。由于高温使突变菌种的酶失去活性 从而导致细胞膜结构的变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸渗透的样 式。从而使得终产物谷氨酸能够不断排除细胞体外。这样就使细胞内谷 氨酸产物不能积累到引起反馈调节的浓度，使得谷氨酸在细胞内不断合 成，在培养基中大量积累谷氨酸。从生物素用量的演变历程来看，许多 工厂已经由传统的生物素“亚适量”工艺发展为新型的生物素“超亚皿适 量”工艺，生物素“亚适量”工艺中的生物素浓度仅为5μg /L以下，而生物 素“超亚适量”工艺中的生物素浓度为5～10μg/ L ，其生物素用量明显增 大。理论上，对于生物索缺陷型菌株，增大用量可提高菌体浓度，在适 当的发酵控制下，当菌体内生物素被消耗至“贫乏”水平，菌体可大量合 成谷氨酸，从而达到提高代谢产物浓度的目的。还有一些学者在培养基 中做文章，改变培养基中的磷酸盐含量，来观察谷氨酸的生产情况，都 得到了不错的效果。谷氨酸发酵的前景很广阔，需要我们更用心的探讨 研究。 2 材料和方法 2.1 实验菌种和试剂
发酵工程实验指导
实验一淀粉酶生产菌的筛选一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。
二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。
淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
三、实验用品1．样品淀粉含量丰富的土样。
2．培养基肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至1000ml，pH7.0。
121℃灭菌20min。
初筛平板培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加水至1000ml，pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。
3．器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验方法1．培养基制备：配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。
冷却凝固待用。
3．样品预处理：取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL 无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。
4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。
微生物与发酵工程实验讲义 2012级
实验一 微生物显微镜直接计数法—血细胞计数板法一、目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。
2．掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
此法的优点是直观、快速。
将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。
由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。
由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
血球计数板构造如图。
血细胞计数板构造A.正面图；B.纵切面图（此处向下可用）计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图10-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图10-2）。
但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。
每一个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm ，所以计数室的容积为0．1mm3（万分之一毫升）。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml 菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A ，菌液稀释倍数为B ，那么，一个大方格中的总菌数 因1ml=1cm3=1000mm3，故1ml 菌液中的总菌数=B A⨯⨯⨯410255=50000A·B （个）同理，如果是16个中方格的计数板则1ml 菌液中的总菌数=B A⨯⨯⨯410164=40000A·B （个）三、器材 1.菌种 酿酒酵母2.仪器或其他用具血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。
食品发酵工程实验指导书模板
《食品发酵工程原理》实验指导书实验一甜酒酿的制作一、实验目的1.通过甜酒酿的制作了解酿酒的基本原理。
2.掌握甜酒酿的制作技术。
二、实验要求三、实验原理以糯米（或大米）经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。
我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。
甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，利用酒药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。
随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。
四、实验所用仪器及材料手提高压灭菌锅，不锈钢丝碗，滤布，烧杯，不锈钢锅。
糯米、酒药。
五、实验步骤和方法1洗米蒸饭将糯米淘洗干净，用水浸泡4h, 捞起放于置有滤布的钢丝碗中，于高压锅内蒸熟（约0.1Mpa, 9min），使饭“熟而不糊”。
2淋水降温用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35℃左右，同时使饭粒松散。
3落缸搭窝将酒药均匀拌入饭内，并在洗干净的烧杯内洒少许酒药，然后将饭松散放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。
盖上培养皿盖。
4保温发酵于30℃进行发酵，待发酵2天后，当窝内甜液达饭堆2/3高度时，进行搅拌，再发酵1天左右即可。
六、实验注意事项1 蒸好的饭应凉至35度以下，以防烫死酒曲中是微生物。
2 装熟糯米的用具应做好消毒，以防杂菌污染。
七、实验预习要求提前预习霉菌和酵母菌的发酵原理。
八、实验报告要求1 发酵期间每天观察、记录发酵现象。
2 对产品进行感官评定，写出品尝体会。
实验二活性干酵母的酒精发酵一、实验目的酒精发酵是典型的糖的无氧酵解途径。
通过实验让学生理解糖的无氧酵解途径并了解厌氧发酵的工艺过程。
二、实验原理在无氧的培养条件下，酵母菌利用糖发酵为酒精和二氧化碳的作用即为酒精发酵，反应式为：C6H12O6 2C2H5OH ＋2CO2通过对表观发酵度的测定，可以判断酒精发酵的进程。