测序技术介绍

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7：poly结构的测序结果 以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会
往往导致测序信号的衰减。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到 该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。
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454 测序平台得到的片段能够达到400 bp，并且 读长的质量高；
1： 测序结果有很多套峰，出现很多N值原因分析：PCR产物直接进行测序，在 PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。 在序列的起始端出现N 值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何 值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。模版本身含杂 合序列，有等位基因。
Solexa 测序平台的性价比最高，在数据量相同的 情况下，测序成本仅为454 测序平台的1/10；
SOLiD 测序平台ຫໍສະໝຸດ 确度能够达到99.94%，在片段 覆盖率为15×时，测序准确度可接近100%。
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2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因 组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发 展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司， 并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行 中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且 准确率达到99%以上。2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍， 读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最 高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超 过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测 序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的 地位。
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2：为什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作为测序引物，所测序列是 从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进 行反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体 中，由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。
3：测序结果和文献资料不一样，为什么?原因有很多，如同一种动物，在不 同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是 PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果 是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。
2 项技术的出现，标志第1 代测序技术诞生。
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每一次DNA 测序反应都由4 个独立反应组成； 由于DNA 双链中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键相连，因此在测
序过程中掺入2′，3′-双脱氧核苷三磷酸———ddNTP（不含 3′-OH），当ddNTP 位于DNA 双链的延伸末端时， 无羟基3′ 端不能与其他脱氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯键， 因此， DNA 双链合成便终止； 若在终止位点掺入ddATP，则新生链末端为A，若掺入ddTTP、 ddCTP、ddGTP，相应地，新生链末端则是T、C 或G。
4：过短的PCR产物为什么不适于直接测序？首先由于一般的PCR产物纯化试 剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化；再者，测序的 前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不适于直接测序。
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5：酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰，酒精挥发 时间过长会导致DNA断裂。
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该测序技术的具体做法如下：将模板、引物、4 种 dNTP（其中含有一种为放射性同位素标记的核苷 酸）与DNA 聚合酶共同保温，形成的混合物包含 许多长短不一的片段， 最后利用聚丙烯酰胺变性凝 胶电泳（SDS-PAGE）分离该混合物，得到放射性 同位素自显影条带图谱，人们依据凝胶电泳图即可 读出DNA 双链的碱基序列组成。
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2006 年 ， Solexa 公 司 也 推 出 了 自 己 的 NGS 系 统 ——Genome Analyzer， 简 称 GA 。 这 套 基 于 DNA 簇 （ DNA cluster ） 、 桥 式 PCR （Bridge PCR）和可逆阻断（Reversible terminator）等核心技术的系 统 具 有 高 通 量 、 低 错 误 率 、 低 成 本 、 应 用 范 围 广 等 优 点 。 2007 年 ， Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最 早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1Gb Analyzer的含义， 而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数 据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了 600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级 的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过 600台/套GA IIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一 家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析 中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。
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自动化测序实际上已成为当今 dna序列分析的 主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型 、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中 310型是临床检测实验室中使用最多的一种型 号。
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在进行DNA测序时，紧接引物的10 — 30 Bases有时不一定能完全读清楚。 由 于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/C rich; G/C Cluster；Poly A、 Poly T的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出 现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板 之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下：
第一个峰，重叠干扰。如果不判读为干扰峰，那就说明样品不纯，如果是基因组DNA， 就很好地说明了样品为杂合子，该位点可能存在SNP现象（T/G）。如果判读为干扰峰， 我们只需认定样品此处碱基为T为行了。
第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G）， 如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。
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6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象? 下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中
含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。 解决办法：重新挑取 单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定 仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。
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1954 年，Whitfeld 等用化学降解法测定多聚核糖核苷酸 序列，是关于DNA 测序技术的较早报道。
1977 年，Sanger 发明DNA 双脱氧核苷酸末端终止测序 法（chain terminator sequencing），
A.M.Maxam 和W. Gilbert 发明DNA 化学降解测序法 (chemical degradation sequencing)，