TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术原理及其路线
TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术原理及其路线
TILLING分析过程。a. 1）使用荧光染料标记基因特异性引物，对 DNA池进行PCR扩增；2）扩增产物经热变性，然后退火随机复性； 3）形成的错配双链DNA分子用S1内切酶切割，然后变性；b.切割 产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，以确定基因发生突变的DNA池。 利用LI-COR凝胶系统的IRD700和IRD800两个通道测定5和3标记的 PCR产物，产物大小可以确定突变点在扩增片段上的位置，在本 例 中 大 概 离 5 端 0.2kb ， 3 端 0.8kb 的 距 离 。
TbyS途径
是指基于生物信息工具支撑的下一代 测序技术在TILLING上的应用，在突变目的 基因扩增后直接高速测序，或采用外显子 俘获策略，使诱变DNA与转录组寡核苷酸杂统TILLING途径；（B）适应于TbyS的途 径
图.新一代高速测序流程图。
应用举例 • 水稻
• 玉米
3）斑马鱼
参考文献 1.High-Throughput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiol.2001,126：480 2.TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Mol Breeding . 2017,37: 14 3.TILLING without a plough: a new method with applications for reverse genetics. Current Opinion in Plant Biology 2005, 8:211–215 4.Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING. BMC Plant Biology 2007, 7:19 5.Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING. BMC Plant Biology 2004, 4:12 6.TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. The Plant Journal (2006) 45, 684–694
定点突变技术的原理和步骤
定点突变技术的原理和步骤嘿，咱今儿来聊聊定点突变技术呀！这玩意儿可神奇了呢！你想啊，就好像是一个特别厉害的魔法，能让基因按照我们的想法来变一变。
那定点突变技术的原理是啥呢？简单来说，就是要精准地在基因的特定位置上搞点小改动。
这就好比是在一个庞大的基因拼图里，准确地找到那一块我们想要动的小拼图，然后给它换个模样。
这可不是随随便便就能做到的哦，得有非常精细的操作和技巧才行呢。
那具体咋操作呢？这步骤可不能马虎。
首先呢，得设计好要突变的那个点，这就像是给要走的路先规划好方向，可不能瞎走。
然后，要准备好各种工具和材料，这就跟出门得带好钥匙、钱包一样重要。
接下来，就是真正开始动手啦！就像一个精巧的工匠，小心翼翼地对基因进行操作。
把原来的那块小拼图取出来，再把我们准备好的新的放进去。
这过程可得特别仔细，不能有一点差错，不然可就前功尽弃啦！做完这些还不算完哦，还得检查检查，看看变的对不对，效果好不好。
这就像我们做完作业得检查一遍一样，可不能马马虎虎的。
你说这定点突变技术是不是很神奇？它能让我们对基因进行精确的改造，为很多领域带来了巨大的帮助。
比如说在医学上，能帮助我们研究疾病的发生机制，找到更好的治疗方法。
在农业上呢，能让农作物变得更优秀，产量更高，品质更好。
想象一下，如果没有定点突变技术，我们对基因的了解和利用会少多少啊！那得是多大的损失呀！所以说，这项技术真的是太重要啦！总之呢，定点突变技术就是这样一个既有趣又有用的东西。
它让我们对基因的操控变得更加精准和有效。
我们要好好利用它，让它为我们的生活带来更多的好处和惊喜。
你说是不是呀？。
TILLING技术原理及其应用研究进展
TILLING技术原理及其应用研究进展王彩芬;安永平;张文银;马静【摘要】TILLING(Targeting Induced Local Lesions in Genomes)是近年来发展起来的一种全新的反向遗传学研究方法,它提供了一种高通量、低成本、规模化的高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术.本文简要介绍了TILLING技术基本原理及其应用研究进展.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2011(030)009【总页数】3页(P66-68)【关键词】TILLING;点突变;遗传改良【作者】王彩芬;安永平;张文银;马静【作者单位】宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁750105;宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁750105;宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁750105;宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁750105【正文语种】中文【中图分类】S335TILLING技术是于上个世纪90年代末期，美国Fred Hutchinson癌症研究中心基础科学研究所的Steven Henikoff研究小组发展起来的［1］。
TILLING 在中文中没有统一的译名，吴海滨［2］等将其译为“定向诱导基因组局部突变技术”。
目前，TILLING技术作为一种反向遗传学研究方法在国外已经应用于多种生物中，如拟南芥、玉米、水稻、百脉根、小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫等。
对于拟南芥，这一技术应用最成熟，已经能够实现流水线操作，大量的突变序列可以用in silico进行分析［3］。
自该技术引入国内以来，许多学者进行了利用研究，目前已在小麦、水稻、玉米、高粱、油菜等作物中应用。
本文介绍了TILLING技术基本原理、特点、核心技术及其在功能基因组学研究、SNP检测、作物遗传改良中的应用研究进展。
其基本原理［4］是:通过化学诱变产生一系列的点突变，经PCR扩增放大，经过变性复性过程产生异源双链DNA分子，再利用能够特异性识别异源双链中错配碱基的核酸酶，从错配处切开DNA，然后进行双色电泳分析筛选突变体。
tilling技术的原理与方法述评
tilling技术的原理与方法述评
Tilling技术是一种基因组高效筛选方法，其原理是利用化学或物理学手段随机诱导出基因组的点突变，并利用高通量测序技术对突变个体进行全基因组测序。
然后，将突变个体与野生型对照组的基因组序列进行比较分析，以鉴定和定位突变，从而快速识别相关基因和突变位点。
通常使用化学诱变剂例如EMS (ethyl methanesulfonate) 或物理诱变剂比如gamma射线，通过随机的方式改变DNA序列，从而导致突变。
突变后生成的杂种子代可以直接用于筛选目标基因，避免了常规定向构建突变库的过程。
Tilling技术的优点是能够快速、高效地筛选出多个基因组突变，而且无需构建特定基因的突变库，因此可以广泛应用于各种生物体中的基因功能分析和基因改良。
总体而言，Tilling技术是一种可靠、快速、高通量的基因组突变筛选方法，应用前景广阔。
TILLING技术及其在农作物中的应用现状
扰 沉默 和插 入外 源 ＤＮ 片段 这 两 种 反 向遗 传 学 Ａ 研 究方 法 ， 通常 伴 随着 转基 因技 术 以及 组 织 培 养
技术 ， 应用 于少 数 物种 ｌ 。ＴＩ Ｌ ＮＧ 技术 则将 仅 ｌ ３ ］ Ｌ Ｉ
Ｔ Ｌ Ｉ Ｇ 操作 流 程 见 图 １ ① 将 干种 子 利用 ＩＬＮ ， 甲基 磺 酸 乙酯 （ ＭＳ 进 行 处 理 ， 其 受 到 诱 导 ， Ｅ ） 使 从 而 产生 一系 列 的 点 突变 ， 用 单 株 种 植 的方 式 采
产 生 Ｍ 株 ； Ｍ 株 自交 ， 植 ② 植 获得 Ｍ 种子 ， 种
生 型和 突变 型 ２种 扩 增 片 段 ； 使用 限制 性 内切 ⑦
酶切 开 异源 双链 ， 通常 使 用 的酶 为 Ｃ Ｌ 酶 ， 能 Ｅ ｌቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ它
有效 识别 出错 配 的碱基 ， 即突变 的位 点 ， 切开 这 并 杂 合双 链 ； ③利 用 电泳 的 方 法分 析 酶 切 后 得 到 的产 物 ， 而 得 到 突变 池 ； 当发 现有 突 变体 时 ， 从 ⑨
它 是一 种 高通 量 、 成本 ， 高效 筛选 由化 学诱 变 低 可 剂Ｅ ＭＳ诱 发 产 生 的 点 突 变 个 体 的 技 术 。近 年 来 ， Ｉ Ｌ ＮＧ技 术 已经应 用 于植物 功能 基 因组 学 ＴＬ Ｉ 的研 究 、 突 变 体 的筛 选 、 ＮＰ 的检 测 和开 发 以 点 Ｓ 及标 记辅 助 育 种 等 方 面 。早 在 ２ ０世 纪 ３ ０年 代 ， 人工 可诱 发 产生 突变 成为 遗传 学发 展史 上一 项最 重 大 的突破 以来 ， 打破 了智 能 研 究 自发 突 变体 的 局 限 ， 动 了之 后 的 遗 传 学研 究 ［ 。对 于高 等 生 推 ２ ］ 物 的各种 遗传 特性 研究 便 可 以通过 对诱 导突 变体 进 行 的基 因功 能研 究来 实现 。由诱导 突 变体 推动
烟草突变体筛选与鉴定方法篇：3.烟草突变体的TILLING筛选与功能鉴定
特点。随着烟草全基 因组测序的完成 ，ＴＬ Ｉ Ｇ在烟草功能基 因组学中的重要价值也越发体现 出来 。 ＩＬ Ｎ
选 技术 如 毛细管 电泳（ ａｉａ ｅｔ ｐ ｏｅｉ， Ｅ）聚丙 烯酰 胺凝 胶 电泳（ ｏｙｃｙａ ｄ ｅｅｅｔ ｐ ｏｅｉ ｃｐｌｒ ｅ ｃ ｏｈ ｒｓｓＣ 、 ｌｙ ｌ ｒ ｐ ｌａｒｌｍｉｅｇｌｌ ｒ ｈｒｓ ， ｃｏ ｓ
Ｐ Ｇ 、琼脂糖 电泳 （ ｇｒｓ ｇｌｌ ｔ ｐ ｏ ｓ ， Ｇ 、高分辨熔解 曲线 （ ｉ ｒｓｌ ｉ ｅ ｉ ， Ｒ ） Ａ Ｅ） ａａ ｅ ｅｅ ｃ ｏｈ ｒ ｉ Ａ Ｅ） ｏ ｅ ｒ ｅｓ ｈ － ｏ ｔ ｎ ｌ ｇＨ Ｍ ｅ ｕｏ ｍ ｔ ｎ
链核酸分子 ；（ ）电泳检测 ，检测手段可通过产生真实 电泳图谱 的 ＬＣ Ｒ ３０遗传分析工作站进行 ，也 ４ ＩＯ ４０
可通过 自动 化程 度较 高 的毛细管 电泳 系统 进行 ；（ ５）采取 相 同 的方 法从 突变 池 中筛选 突变 个体 ；（ ）突变 ６
个体 Ｐ Ｒ产物的测序验证。 Ｃ
高水平 的突变剂量 ，多倍体的突变频率要显著高于二倍体 ，如二倍体植物拟南芥、水稻 、玉米的突变频率
分别为 １ ７ 、１ ０ ｂ ／ ５ ｂ 而多倍体植物普通小麦突变频率 １ ４ ｂ 普通烟草约为 １ ６ ｂ 因 ／ ０ ｂ ／ ０ 、１ ８ ， １ ｋ ５ ｋ ４ ｋ ／ ， ２ｋ ／ ， ６ｋ
此要使基因组中 ９％以上 的基 因都有突变信息 ，多倍体植物如普通小麦 ＴＬ Ｉ Ｇ检测群体很少超过 ５０ ５ ＩＬ Ｎ ００
TILLING技术及其基因突变克隆
论文题目 TILLING技术及其突变基因克隆作者管家伟学号 12223104指导教师王沛政专业班级非师范2班完成日期： 2015 年 6 月 18 日TILLING技术及其基因突变克隆摘要：TILLING[1]（定向诱导基因组局部突变）技术是近年发展起来的一种高通量筛选化学诱变技术。
是一种全新的反向遗传学研究方法,它提供了一种高通量、低成本规模化高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。
本文简要介绍了TILLING的原理和技术优势,并对其在植物功能基因组学[2]、突变分子育[3]种和预测突变频率中的应用作了初步探讨。
关键词: TILLING；点突变；植物功能基因组学；突变分子育种；克隆1 TILLING技术介绍1.1 TILLING技术基本原理通过化学诱变产生一系列的点突变，经PCR 扩增放大，经过变性复性过程产生异源双链DNA 分子，再利用能够特异性识别异源双链中错配碱基的核酸酶，从错配处切开DNA，然后进行双色电泳分析筛选突变体。
该技术将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR 筛选技术和高通量检测方法有效结合，可以发现分析目标区域点突变，是一种全新的高通量、低成本的反向遗传学研究方法。
1.2 TILLING技术的发展TILLING技术开始是利用变性高效液相色谱(DHPLC)来检测DNA池中的突变的[4,13],但这种检测手段不能用于大规模的突变体筛选,TILLING技术的应用也仅少数物种突变体库的筛选和突变体检测。
随着应用领域的不断拓宽,TILLING技术也逐步得到了发展和完善。
1.2.1 双色红外荧光扫描对TILLING技术的作用双色红外荧光扫描系统的引入提高了突变筛选效率双色红外荧光扫描系统的出现大大提高了突变筛选效率。
该系统是利用一对不同荧光进行标记的引物来扩增几个样品混合后的DNA模板,PCR产物经变性后再逐渐复性,如果在混合的DNA样品中存在一个突变样品,那么扩增产物中就会形成异源双链分子,这些异源双链分子即可被核酸内切酶剪切,酶切产物利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
定向诱导基因组局部突变技术研究及应用进展
定向诱导基因组局部突变技术研究及应用进展摘要:定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术是反向遗传学中研究功能基因的一种全新的方法｡TILLING技术借助高通量检测手段,快速有效地从突变群体中鉴定出点突变｡系统介绍了TILLING技术的基本原理和技术路线,同时总结了TILLING技术本身有待解决的一些问题｡关键词:定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术;反向遗传学;点突变;检测Research and Application Progress on TILLING TechnologyAbstract: TILLING(Targeting induced local lesions in genomes) technology is a nove1 reverse genetics strategy that provides a completely solutions for high throughput and low cost discovery of induced point mutations in populations of chemically mutagenized individuals. The TILLING methodology and its technological routine were introduced. Meanwhile, some problems in TILLING were presented.Key words: Targeting induced local lesions in genomes(TILLING); reverse genetics; point mutations; detection诱导突变一直是遗传学发展的主要动力之一｡在各种诱变方法中,化学诱变应用特别普遍｡化学诱变剂中的烷化剂类能与核苷酸结合,从而造成互补碱基的错配,进而引起复制后的碱基系列改变｡例如EMS(甲基磺酸乙酯)使鸟嘌呤(G)烷基化,生成O6-鸟嘌呤,后者能与胸腺嘧啶(T)配对而不再与胞嘧啶(C)配对[1]｡适宜浓度的EMS诱变具有染色体断裂较少(染色体断裂可引起突变体染色体非整倍化､不育甚至显性致死)､点突变频率高的优点,因此EMS的诱变效果通常比较好[1,2]｡化学诱变剂处理后产生的突变多为点突变,其中发生在蛋白质编码区的突变可分为三类:无义突变､沉默突变､错义突变｡对于功能基因而言,EMS诱导的点突变可产生静息基因(null allele或silent gene)､条件型等位基因(conditional allele)或只影响特定的蛋白质结构域,所有这些突变型对阐释目标基因的功能非常有益[3]｡随着大规模测序数据的积累,科学家们对基因组的注意力从基因的结构转向基因的功能,而这就依赖于反向遗传学的发展[4]｡反向遗传学研究方法常分为两类,一是特定目标位点的定向诱变,另一个就是全基因组范围内的诱变和筛选｡前者常用反义RNA抑制或RNA干扰(RNA interference,RNAi)来实现,后者常用T-DNA 随机插入或转座子标签法来实现[5]｡但是,要获得并分析基因组中每个基因的敲除突变体并不容易｡目前,对RNAi的研究十分热门,然而RNAi的功效仍旧不明朗,主要表现在后代表型的多样性及不可预见性｡同时,由于上述技术均依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统,需耗时的转基因和复杂的组织培养技术,作为常规方法加以应用目前仅限于少数物种｡当然,还有一些其他研究方法,但都存在不少问题(表1)｡因此,在拟南芥等模式生物测序完成后,迫切需要一种新的兼具自动化､适用性广､突变率高的反向遗传学工具用于功能分析｡TILLING技术就是在这一背景下应运而生的[6]｡1 TILLING技术的原理TILLING(Targeting induced local lesions in genomes)技术是美国华盛顿Fred Hutchinson癌症研究中心以Steven为首的科学家发展建立的[7],它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和高通量检测方法有效结合,以便发现､分析目标区域点突变,是一种全新的高通量､低成本的反向遗传学研究方法｡TILLING技术的原理是先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变,再根据目标基因设计特异性引物,对目标基因进行PCR扩增,而后将PCR扩增产物变性退火生成错配的异源双链核酸分子,利用仪器分析技术区分出纯合双链和异源双链｡为了增加通量,避免假阳性,它将突变群体若干个个体样本的DNA混合建池(如拟南芥ATP项目组用8个单株建成8倍池),在检测出含突变体的混合池后再对该池中的每个个体分别重新进行PCR扩增,验证混合池是否为假阳性并确定对应的突变个体｡在明确突变体后,再对目标基因测序,测序结果可以再次验证是否真的为阳性突变｡1.1 群体准备产生适合TILLING技术的诱变群体要求考虑以下因素:目标群体的遗传组成､诱变剂的种类和处理方式､DNA提取与建池策略等｡目标群体的遗传组成最好比较简单,首选纯合自交系｡并且为了减少亲本个体间的遗传差异,在保证能产生数千子代的前提下,应当选择单个或尽可能少的供体亲本｡这方面,有些单倍体育种技术开展得比较成功的作物(如甘蓝型油菜等)无疑具有比较优势｡而且只要有可能,供体亲本就应当选择大部分测序信息已经知道的株系或品种｡诱变剂应选择点突变率高的诱变剂｡EMS由于突变密度高､使用简便可靠而倍受青睐｡拟南芥种子EMS突变体后代中,点突变随机分布在染色体组上,其中编码区5%突变为编码产物的提前终止突变,50%为改变编码蛋白氨基酸系列的错义突变[8]｡诱变强度也是考虑因素之一,同样处理的诱变方法在不同物种中的突变率相差很大｡诱变会出现致死和不育现象,所以应在突变率､致死率和不育率之间找到平衡｡例如果蝇EMS诱变剂量为50 mmol/L时,平均每155.6 kb发生一个突变(1/155.6 kb,下同);当剂量提高到125 mmol/L时,突变频率增加到1/90.5 kb,但F2存活数从1 915只(50 mmol/L)锐减至171只(125 mmol/L)[3]｡比较已有研究结果中的EMS诱发突变的频率,相差最高达40倍｡适宜浓度下最高突变率为六倍体小麦(1/25 kb),接下来依次为四倍体小麦(1/40 kb)[9],果蝇(1/155.6 kb)[3],拟南芥(1/170 kb)[8],斑马鱼(1/230 kb)[10,11],玉米(1/500 kb)[12,13],水稻(1/500 kb)[14]和大麦(1/1.4 Mb)[15],这些数据可能表明影响突变率的是生物体的倍性而不是基因组大小,多倍体生物可能耐受更高剂量的EMS｡但总体上,诱变处理后变异的分子机理方面的信息还不多,今后这方面的工作可能对改进TILLING技术很有帮助｡3 TILLING有待解决的问题虽然TILLING是反向遗传学研究领域的一把利器,但在实际应用中有些技术尚需改进｡1)诱变强度(包括诱变剂浓度､处理时间)和处理方式是影响TILLING效果的很重要的因素｡如前文所述,不同文章报道的诱变结果相差很大｡虽然有多倍体可能更耐EMS处理的推测,但针对不同物种何种诱变强度和处理方式最佳,实际工作中常常只能凭经验来确定,今后可能还要在这方面做系统的研究[16]｡2)突变体的保存也是个问题｡对多个功能基因的研究是相当费时的工作,在研究完成前,如何保存突变体?对植物而言,低温保存可以解决这个问题｡而对动物来说,就比较难了｡Stemple领导的研究小组收集了6 000条斑马鱼用于TILLING计划,如此大的群体,饲养工作和饲养空间无疑增加了实验成本,而且由于寿命限制,还必须在鱼死亡前完成突变体检测和表型验证工作｡期间部分个体的死亡不可避免,而这些个体可能就是突变基因的载体[27,28]｡3)功能基因的突变与对应突变表型的分析仍然有大量工作要做｡一旦点突变被发现后,对那些引起编码蛋白功能损伤的突变就要进行表型分析｡但化学诱变引入了大量点突变,使得表型分析变得相对困难｡例如MaCallum等首次报道了用TILLING研究甲基化酶CMT3等位基因,但一年多以后才完成详细的表型分析｡TILLING突变体越多,表型鉴定就越慢｡而且,除了敲除突变,等位基因还可能有其他差异表达,所以下游工作变得更复杂｡在基因组存在大量背景突变的前提下,如何避免把背景突变的表型误检为目标基因的表型,这些问题,就连TILLING领域的权威Steven等人[6]也感到“如同潮水般涌现的基因组测序结果一样,突然出现的大量突变体材料令每个研究人员束手无策”｡也许,解决这个问题还得依靠多国科学家共同努力｡参考文献:[1] ASHBURNER M. 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TbyS途径
是指基于生物信息工具支撑的下一代 测序技术在TILLING上的应用，在突变目的 基因扩增后直接高速测序，或采用外显子 俘获策略，使诱变DNA与转录组寡核苷酸杂 交后再ING途径；（B）适应于TbyS的途 径
图.新一代高速测序流程图。
应用举例 • 水稻
关键节点
1）诱变过程 诱发突变既可采用金典的化学诱变如EMS， 也可以采用物理诱变如辐射诱变，或者利用自然突变群体。 诱变过程应进行小规模的预实验，通过对诱变效率和致使效 应的折衷，选择适合的诱变剂量。 ＥＭＳ是一种单功能烷化剂，在体内可以转变成缺电子 的活泼中间产物，容易与碱基上的Ｎ原子和磷酸基团发生亲 核取代反应，通过2条途径使基因突变。一是碱基的烷基化 效应，鸟嘌呤（Ｇ）的Ｎ７位易被烷基化，形成带正电的季 铵基团，产生２种可遗传的效应：１）促进Ｎ１上的Ｈ解离， 使Ｇ与Ｔ配对，导致Ｇ：Ｃ转换成Ａ：Ｔ；２）削弱了Ｎ９ 位的糖苷键，发生脱嘌呤作用，如果脱嘌呤位点在ＤＮＡ复 制之前未被修复，则该位点在复制时将随机插入任何一个碱 基，经过一轮复制后，可能发生Ｇ：Ｃ到Ａ：Ｔ的转换，也 可能发生Ｇ：Ｃ到Ｃ：Ｇ或Ｔ：Ａ的颠换；二是磷酸基团的 烷基化效应，磷酸基上的Ｏ原子被烷基化后，形成不稳定的 磷酸酯，容易发生水解，使核苷酸从磷酸与五碳糖间切断， 导致ＤＮＡ断裂，产生染色体缺失。位点突变引起基因功能 的改变主要包括：错义突变，无义突变和剪接突变。
图 . 跑胶通道 IRD800 （左） 和 IRD700 （ 右 ） 的 影 像 ， 诱 变 带 被 框 出 ， IRD700 中的截图标在最右边， 注意一个通道的泳道浮 现在背景上只有一个带， 另一通道是相应的带， 二者大小相加等于扩增 产物的全长（最上端的 带），胶下端泳道的若 干的条带是随机错误引 导所产生的小片段。
7）PCR的扩增片段经变性、退火，得到野生型和 突变型碱基错配的异源双链核酸分子； 8）用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶 celⅠ切割异源双链核酸分子，在错配位点单链的3 端切开； 9）变性酶切产物得到完整单链(无突变碱基)和单 链片段（突变点被切开所致）； 10）酶切产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离； 11）用Photoshop对凝胶进行图像分析，如某一 泳道有突变带，则在700nm和800nm的图像中，均会 在野生型条带下方看到一个新的条带，这2个条带片 段大小之和等于野生型条带长度，由新增2个条带的 移动距离可以大体上估计突变距目标区域5或3的距 离； 12）回溯发现带有突变的DNA池对应的保存样品， 重复5-11过程锁定突变单株。
2）突变群体 为了使突变能够产生分离表型变异， 突变群体一般不选嵌合的M1代，而是选择突变M2 代，但是若是花粉诱变则可以选择其M1代，如玉 米品种。在知道诱变频率的情况，产生目标基因 突变所需要的群体大小可以估算。 3）DNA池 为了提高分析通量，一般构建8倍的 DNA样品池，如果品种的突变频率较高，突变群 体较小时，样品池也可以较小。构建基因池时, 要确保各个单株的DNA等量混合，为此一般分析 平台已采用机械手加样。
• 玉米
3）斑马鱼
参考文献 1.High-Throughput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiol.2001,126：480 2.TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Mol Breeding . 2017,37: 14 3.TILLING without a plough: a new method with applications for reverse genetics. Current Opinion in Plant Biology 2005, 8:211–215 4.Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING. BMC Plant Biology 2007, 7:19 5.Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING. BMC Plant Biology 2004, 4:12 6.TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. The Plant Journal (2006) 45, 684–694
图.基因诱变组学的正向和反向遗传学操作的路标。
技术特点
• 点突变是随机分布的饱和突变，可获得大量的等 位基因系列，对长度很小的基因，复等位基因等 具有独特的反向遗传学技术优势。 • 诱变频率高，为筛选特定目的基因所需的突变群 体小。 • 不依赖农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗 时的基因操作和繁琐的组织培养。 • 但需要预先知道所研究基因的序列。
TILLING分析过程。a. 1）使用荧光染料标记基因特异性引物，对 DNA池进行PCR扩增；2）扩增产物经热变性，然后退火随机复性； 3）形成的错配双链DNA分子用S1内切酶切割，然后变性；b.切割 产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，以确定基因发生突变的DNA池。 利用LI-COR凝胶系统的IRD700和IRD800两个通道测定5和3标记的 PCR产物，产物大小可以确定突变点在扩增片段上的位置，在本 例 中 大 概 离 5 端 0.2kb ， 3 端 0.8kb 的 距 离 。
TILLING（定向诱导基因组局部突变） 技术原理及其路线
中国农业大学 齐孟文
TILLING是后基因组时代出现的，一种 将烷基化试剂EMS或辐射诱导的位点突变技 术，与特定基因的PCR扩增技术和突变单核 苷酸多态性检测技术或下一代基因俘获高 效测序技术相结合的反相遗传学方法。提 供了一种几乎对所有物种都适应的、低成 本、高通量和自动化的诱发突变筛选技术。 该技术也可用于天然群体自发突变的筛选， 称之为Eco-TILLING。
图.8倍池的构建策略。
4）SNP检测，酶切产物的凝胶电泳多采用 的美国IE-Col公司的双色红外荧光检测的 专利技术分析，因为红外光检测的背景低， 700nm和800nm通道间间没有重叠，能有效 的排除假阳性，可靠的发现和确定突变。 5）改进措施
图.高通量TILLING的服务组织，最新和最期待的改进。Squinting 指的是辅助凝胶检测，用当前使用的GelBuddy软禁确定新的DNA片 段。
操作流程
操作流程 1）用甲基磺酸乙酯处理种子诱导位点突变； 2）播种诱变处理种子，按单株种植得到诱变 M1代植株； 3）播种M1代种子得到诱变M2代植株，自交获 得M2代种子并保存建库； 4）按单株提取M2代组织DNA，存放于96孔微孔 板建库； 5）5-8倍混合单株DNA库，构建DNA样品池以增 加扫描通量； 6）针对目标基因设计特异性引物，采用700nm 和800nm荧光染料标记引物，对DNA目标区域进行 PCR扩增；