中关村华康基因研究院----DNA甲基化测序问题集锦
DNA测序常见问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。
DNA测序技术的使用中常见问题
DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。
然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。
1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。
低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。
常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。
解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。
- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。
- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。
2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。
然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。
解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。
- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。
3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。
然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。
解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。
选择合适的方法来检测特定类型的突变。
- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。
- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。
4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。
引物测序直播问题及回答
1、我想问下：为什么引物不能退火之后跑胶验证纯度呢？两条引物退火成功率达不到百分之百，里面会存在单链引物，引物退火后跑胶有杂链很正常，不能以此来判断单链引物纯度。
2、老师您好，我想自己设计测序引物，请问对于测序引物有什么要求吗？在待测目的基因前面100bp左右设计引物，GC含量不能太高或太低，3’端不能有错配，引物的长度建议是18-20bp以内。
3、甲基化的建议反向测序,是什么意思?正向测序有甲基化的结构，会导致测序峰图双峰或者严重的时候导致信号突然中断，就可以反向测序，然后正反双向测序结果拼接起来就可以得到完整的序列。
4、老师请问一个测序反应有效的大概有多长?普通序列一个测序反应有效长度大概是800bp左右。
5、请问RNA最长能合多少呢30bp以内。
6、稀释后引物保存时间多久？稀释后的引物一般4℃保存3个月内是没有问题的7、你们的积分的兑换时间有限制吗？积分不清零的8、测序为什么前70bp不准呢一代测序，由于仪器的缺陷，所以前面会有几十bp是不准确的，严重的时候会有70bp左右不准确。
9、老师请问那引物最长能合多长呢？引物最长能合139bp。
10、金开瑞引物合成与外面其他公司引物合成相比，优势有哪些？我们公司技术服务内容比较多，内部和外部引物合成需求都是一起合成，效果和质量的反馈方面，我们综合有内部使用和外部使用反馈，更全面。
11、只做常规的pcr，用什么纯化方式的引物呢?常规的pcr脱盐纯化就可以满足实验了。
12、引物测序时，单向、双向、测通之间的具体区别是什么呀？这个主要是根据待测目的序列的长度来决定的，如果待测目的序列700bp以内的话可以选择正向或者反向都行；1500bp以内的序列一般双向测序就可以了；如果是待测目的序列大于1500bp就可以填测通，这边会根据测序结果自动安排测序反应，直到完全测通，我们会默认测通后拼接。
13、不同纯化方法,你们收费不一样是吗不一样的，脱盐纯化<PEGA纯化<HPLC纯化。
DNA测序分析常见问题整理
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子 原因：挑克隆时两个质粒混在一起 对策：新挑克隆，重新制DNA
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要 吸进注射器； – 样品纯化干净。
有机物污染（瀑布效应）
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
DNA测序中的一些常见问题和对策
其抗 <+ 抗体属中和抗 $%&’# 和 $%&’! 的共同抗原决定簇， 体， 中和病毒的能力最强， 能与 $%& 的 <+ 抗原特异结合， 结 果改变了病毒的表面结构， 阻断了病毒对宿主细胞的吸附，
［@］ 使病毒失去了感染能力 。本实验所用的 5678% 中既有能
识别 $%& 的 <;、 也有 <+ 抗原的型共同性特异性单克隆抗体， 能识别 $%& 的 <= 的型特异性单克隆抗体， 体外中和试验也 证明其中和效价为 #( 2 #( ， 具有很强的中和病毒的作用
［$， %］ 序， 都存在下列问题 。
点琼脂糖凝胶回收并用专用试剂盒纯化， 注意纯化后要进行 电泳检测。 # 测序信号提前共同终止， 测序反应无法继续进行
［@］ 、 常见原因： 模板 !"# 中有二级结构形成 8"?& 浓度不
当或模板浓度过大， 导致测序反应提前终止。 对策： 一般商售试剂盒中配套试剂很少出现问题， 若为 自制试剂， 可予替换或重新配制， 再重复实验。由于测序反 应要求模板必须为单链， 所以对于二级结构形成导致的测序 反应共同终止， 可以提高模板变性温度使之充分分解为单 链， 或加入甲酰胺使模板变性充分、 彻底。 $ 无正常测序信号 常见原因： 引物设计不当或模板 3A’ 含量过高。 对策： 测序引物通常分为通用引物和特异性引物。前者 是针对不同克隆载体设计的引物， 一般不会存在上述问题。 特异性引物是指与模板特异性且唯一性结合的引物， 设计原 则如下： （$） 引物长度 ! $= .B， 一般 %)%C .B； （ %） 3A’ 含量 ! 一般为 C)D<)D （ ；@） 避免引物自身形成互补； （ E） C)D ， @F 末 端为 3 或 ’ 更为合理。模板 3A’ 含量过高者可采用专门为 高 3A’ 含量模板设计的测序试剂盒。 靠近引物的区域， 其测序信号可能由于引物峰遮盖而无 法阅读， 是 测 序 的 难 点。可 以 尝 试 加 入 /*% G（ $)) HH64 , I
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。
另外，较长的引物纯度也将难以保证。
通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。
我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。
DNA测序常见问题分析及解决办法
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
关于DNA测序服务的说明
1、如需TA克隆后测序，提供PCR产物的量不少于50ul。我们在收到样品后，先进行回收纯化，再进行克隆实验。
2、目的基因亚克隆实验，请提供含有目的基因的质粒及亚克隆载体质粒，如果质粒量少请提供保存菌种，我们需要额外收取转化或质粒提取费用。我们在收到样品后，先进行预实验检测，检测结果与背景资料一致时开始实验。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
只测OD值不可靠
总量是否足够
测序出现双峰
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化或纯化不好。重新合成引物测序。
信号
信号迅速衰减或
中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
模板GT二级结构区后
现象
可能原因
是否收费
收
不收
反应无信号或全部杂峰
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
不收
质粒抽提未成功
质粒太大或活化方式不好、转化不好
不收
鉴定质粒或PCR浓度
建议50ul(pcr)/20ul(质粒)去离子水溶解
不收
帮助客户设计引物和序列拼接
不收
300bp以前中断或衰减
DNA测序过程可能遇到的问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP 终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。
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DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA 序列的前提下，改变遗传表观。
DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用，目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。
Roche GS FLX Titanium 、IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4均可以进行大规模DNA甲基化测序分析，由于IlluminaSolexa GA IIx测序仪具有数据读取量大、成本低等优势， IlluminaSolexa GA IIx测序仪在DNA甲基化测序方面得到广泛应用。
DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA 甲基化谱式绘制，并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。
甲基化测序对样品有什么要求？
答：（1）请提供浓度≥10 ng/μg、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次富集的DNA量不够，建议将2~3次免疫沉淀的DNA合并在一起。
（2）样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。
在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中，再将50 ml管放在封口袋中。
为了防止低浓度样品黏附在离心管壁上，请使用
non-stick tube运输DNA ；建议使用冰袋运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。
MeDIP富集DNA片段的流程？
答：甲基化DNA免疫沉淀法（Methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）是一种高效富集甲基化DNA的方法。
主要通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀，形成富集。
其流程如下（图1）：
（1）将基因组DNA超声打断成400-500bp片段；
（2）加热变性，使双链DNA片段解链形成单链DNA样品；
（3）向变性后的单链DNA样品中加入5’-甲基胞嘧啶抗体；
（4）使用亲和层析分离（3）步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。
纯化得到甲基化DNA片段（MeDNA）。
甲基化测序文库构建方法？
答：通过使用5’-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，并结合Solexa高通量测序平台进行甲基化测序，首先需要对所富集的DNA片段进行前处理，构建测序文库。
其方法如下：（1）对富集的双链DNA进行末端修复；（2）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；（3）使用特定的测序接头连接DNA片段两端；（4）纯化连接产物；（5）高保真聚合酶PCR扩增连上接头的DNA片段；（6）检测测序文库。
MeDIP-seq比其他的甲基化研究方法有什么优势？
答：灵活度高：能够直接对任意物种的高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息；检测范围广：覆盖整个基因组范围的甲基化区域；精确度高：能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位；数字化信号：直接对甲基化片段进行测序和定量，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
各种方法的优缺点如下：
哪些因素会影响甲基化测序结果的质量？
答：由于进行DNA甲基化测序前，需要对样品进行DNA免疫沉淀富集，富集过程中反应条件是否合适，直接影响到富集甲基化DNA的量，另外还需要保证处理过程中测序样品无污染，否则会严重影响测序结果的质量；DNA免疫沉淀富集后，如果DNA的量过少，需要进行PCR扩增，PCR过程会产生偏差，影响样本甲基化结果的分析。