全基因组重亚硫酸盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序分析流程
亚硫酸盐测序
亚硫酸盐测序
氨基有机硫酸盐氧化物（Thiophenols）是环境、污染领域重要的精细指标，在大气
颗粒物、饮用水、地下水、水环境、工业排放气体及油土中等领域，都有广泛的应用。
由
硫酸异氰酸酯（ISCOM）组装的氨基有机硫除去剂，是目前应用最为普遍、成功率最高的
方法。
氨基有机硫酸盐是指含具有硫杂环、氨基和硫酸基等特征的有机物，如硝酸溴苯酚（BP）、硫磷（TP）、硫代苯磺酸（TSA）等。
氨基有机硫酸盐可以通过气相色谱/质谱（GC/MS）、气相色谱-质谱联用（GC/MS/MS）来进行测试及检测。
气相色谱/质谱仪将氨基有机硫酸盐样品的分子团解，从而进行分析，有助于准确测定氨基有机硫酸盐含量。
在这一测试中，首先需要对样本进行液相色谱分离，然后将样品注入气相色谱柱，进行挥发性多环芳烃（BTEX）检测，从而消除室溫效应等干
扰因素，确保试验测试的准确性。
之后进行质谱分析，来定性、定量分析氨基有机硫酸盐
的种类、含量。
总之，氨基有机硫酸盐测序通过气相色谱/质谱（GC/MS）、气相色谱-质谱联用
（GC/MS/MS）、液相色谱联用质谱联用仪（LC/MS/MS）来完成，是当前硫分析领域应用最
为普遍、检测精度高的方法，给监测氨基有机硫酸盐的应用提供了更加可靠的依据。
重亚硫酸盐测序技术介绍PPT课件
未来重亚硫酸盐测序技术将进一步优化测序精度，降低测序错误率， 提高数据分析的可靠性。
测序成本不断降低
随着技术的成熟和规模化生产，重亚硫酸盐测序技术的成本将逐渐 降低，使得更多人能够享受到基因测序的益处。
在生物医药领域的应用前景
疾病诊断与预测
重亚硫酸盐测序技术可用于检测与特定疾病相关的基因变 异，从而为疾病的早期诊断和预测提供依据。
其他应用领域
进化生物学研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以对不同物种的基因组 进行比较分析，研究物种进化关系和演化历程。
药物研发
通过重亚硫酸盐测序技术，可以对药物作用靶点进行 精准定位，为新药研发提供有力支持。
生物多样性研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以研究生物多样性，包 括物种分类、种群结构等。
03
比较与选择
重亚硫酸盐测序技术
在DNA序列分析中，重亚硫酸盐测序技术是一种基于连接反应和重亚硫酸盐转化的序列 特异性扩增技术。它具有高灵敏度、高特异性和可检测突变丰度的优点，因此在基因突变 筛查、基因分型和突变体鉴定等领域具有广泛的应用价值。
与其他测序技术的比较
与第二代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的通量更高，能够检测低丰度的突变；与第 三代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的准确性更高，适用于对准确性要求较高的应用 。
代表性技术
基于PCR扩增和光学检测的Sanger测序法。
特点
准确性高，但通量低，测序长度短，主要用于完成人类基因组计划等基础研究。
第三代测序技术
代表性技术
基于纳米孔的单分子测序技术（如PacBio RS II）和合成式测序技术（如Illumina MiSeq）。
特点
高通量、长读长，但准确性相对较低，主要用于临床诊断、基因组组装和基因表达分析 等应用。
全基因组测序实验流程
全基因组测序实验流程英文回答：Genome sequencing is a powerful technique used to determine the complete DNA sequence of an organism's genome. It provides valuable information about the genetic makeupof an individual or a species, allowing researchers tostudy the structure and function of genes, identifydisease-causing mutations, and understand evolutionary relationships.The process of whole-genome sequencing involves several steps. First, DNA samples are obtained from the organism of interest. These samples can be collected from blood, saliva, or tissue samples. Next, the DNA is extracted and purifiedto remove any contaminants. This ensures that the sequenced DNA is of high quality and free from interference.Once the DNA is purified, it is fragmented into smaller pieces. This can be done using physical methods, such assonication, or enzymatic methods, such as restriction digestion. The resulting DNA fragments are then ligatedwith adapters, which allow for the attachment of sequencing primers.The prepared DNA fragments are then amplified using a process called polymerase chain reaction (PCR), which produces multiple copies of the DNA fragments. This step is necessary to ensure that there is enough DNA for sequencing.The next step is sequencing the DNA fragments. Thereare several sequencing technologies available, including Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS). Sanger sequencing, also known as capillary electrophoresis sequencing, was the first method developed for DNA sequencing. It involves the use of fluorescently labeled nucleotides to determine the sequence of the DNA fragments.NGS technologies, such as Illumina sequencing andPacific Biosciences sequencing, have revolutionized thefield of genomics. These methods allow for the simultaneous sequencing of millions of DNA fragments, resulting in amuch faster and more cost-effective process.After sequencing, the raw data is generated in the form of short DNA sequences called reads. These reads are then aligned to a reference genome or assembled de novo to reconstruct the complete genome sequence. This step requires advanced bioinformatics tools and algorithms to accurately assemble the reads.Finally, the assembled genome sequence is analyzed to identify genes, regulatory elements, and other functional elements. This can involve comparing the genome sequence to known databases, predicting gene coding regions, and studying the genetic variation within the genome.中文回答：全基因组测序是一种强大的技术，用于确定生物体基因组的完整DNA序列。
重亚硫酸盐测序技术介绍
DNA甲基化含义 DNA甲基化含义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5 mC） DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7 mG） 呤（7-mG）
启动子的CpG岛 启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 起始” 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
重亚硫酸盐测序
CpG岛 基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二 核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5′区 域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基 因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基 化可导致基因转录被抑制。 位于多种脊椎动物已知基因转录起始位点周 围、由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重 复序列。
DNA甲基化含义 甲基化含义 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集 DNA 中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基化 位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲 基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。 DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤 （7-mG）
重亚硫酸盐修饰直接测序技术
亚硫酸氢盐技术
基本原理
亚硫酸氢盐能使单链DNA的胞嘧啶脱氨变成 尿嘧啶，而5‘甲基胞嘧啶无变化，在CpG两 端设计引物，扩增出所需片段后进行直接测 序，TG为非甲基化位点，CC为甲基化CG位 点。从而获取CpG岛内所有的甲基化位点。
含有很多CpG 结构, 2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳 原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特 定三维结构。基因组中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未 甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛, 位于结构基因启动子的核 心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化, 使 DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点, 以及DNA 酶的敏感位点, 使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 失去转录活 性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能 导致基因置换突变, 发生碱基错配: T2G, 如果在细胞分裂过 程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症, 而且, 生物体甲基化 的方式是稳定的, 可遗传的。
基因组重测序 流程
基因组重测序流程Genome resequencing is a crucial process in modern biological research. 基因组重测序是现代生物研究中至关重要的过程。
It involves the mapping and sequencing of an individual’s genetic material to identify variations and mutations that may be associated with specific traits or diseases. 它涉及对个体遗传物质的映射和测序，以确定可能与特定特征或疾病相关的变异和突变。
This process has revolutionized our understanding of genetics and has had a profound impact on fields such as personalized medicine, agriculture, and evolutionary biology. 这一过程彻底改变了我们对遗传学的理解，对个性化医学、农业和进化生物学等领域产生了深远影响。
One of the key reasons for conducting genome resequencing is to identify the genetic basis of certain traits or diseases. 进行基因组重测序的一个关键原因是确定某些特征或疾病的遗传基础。
By comparing the genetic sequences of different individuals, researchers can pinpoint specific genetic variations that may contribute to the development of certain traits or diseases. 通过比较不同个体的基因序列，研究人员可以找出可能有助于某些特征或疾病发展的特定遗传变异。
重亚硫酸盐测序技术介绍
在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 此方法可方便地应用于任何序列的甲基化状态的分析，能对甲基化的等位基因进行半定量，获得甲基化和未甲基化等位基因的比例；
大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序的应用
最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的 house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身 就会存在于DNA中，因此不易被 修复，所以被淘汰。故CpG在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
重亚硫酸盐测序技术介绍
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点 若 无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。
在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故灵敏度较MSP差。 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有 CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺ห้องสมุดไป่ตู้啶。 PCR法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶切完全，否 则会出现假阳性。 当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。
全基因组重亚硫酸盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序分析流程
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程介绍WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图分析结果示例图片展示示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]示例图来源文献[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。
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#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程
介绍
WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究
1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；
2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；
3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图
分析结果示例图片展示
示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]
示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]
示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]
示例图来源文献
[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。