实验四 微生物平板菌落计数法
菌落计数的方法
菌落计数的方法
平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。
方法：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
检验方法：
菌落总数的测量，通常将被检样品做成几个相同的10倍递减稀释液，然后从每个稀释液中分别抽出1ml放在杀菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培育一定时间后，记录每个平皿中构成的菌落数量，依据吸收倍数，排序出来每克（或每ml）完整样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释——倾注平皿——培养48小时——计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处置、吸收、蕴含平皿至计数报告无何显著相同，只是在某些具体内容建议方面稍存有差别，例如有的国家在样品吸收和蕴含培育入，对液体内液体的流速，稀释液的震荡幅度、时间和次数以及置放时间等均并作了比较具体内容的规定。
平板菌落计数法水中微生物的检测
钟，每个平板上生长得到的菌落不超过15 个——无菌室
1、采样： 四、实验步骤
1）自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼 烧灭菌，再开水龙头使水流5min，以灭菌 采样瓶接取水样备用。
(2)池水、河水或湖水等地面水源水：在距岸边5米处， 取距水面10—15cm的水样，先将灭菌的带塞的采样瓶， 瓶口向下浸入水层中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水 即流入瓶中，盛满后，将平塞盖好，从水中取出，若不 能在2h内检测的，需放入4℃冰箱中保存。
1、样品充分混匀，稀释时一个稀释度要换一支无 菌移液管（放菌液时 吸管尖不要碰到液面
2、由于细菌易吸附玻璃器皿表面，菌液加入后应 尽快倒培养基，立即摇匀；
3、倾注平板时的培养基温度冷却至45℃左右。 4、计数时，30―300个菌落的稀释度计算每毫升
的菌数最为合适 5、同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊
295
46
1.6
3 2890
271
60
2.2
4 无法计数 4650 513
___
5 27
11
5
___
6 无法计数 305
12
___
7 无法计数 无法计数 无法计数 ___
16400 37750 27100
1.6×104 3.8×104 2.7×104
513000 270 30500
5.1×105 2.7×102 3.1×104 10-3 无法计数
菌落计数方法及原则：
1）若只有一个稀释度的平均菌落数在30-300范围 时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之。
2）若有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30~300之间，则视二者之比值来决定，若 其比值小于2应报告两者的平均数。若大于 或等于2则报告其中较小的菌落总数。
平板菌落计数法
平板菌落计数法目的对目标微生物进行简单计数，测定活菌含量材料和器皿（1）菌种：2012年12月12日15:30取自艾草桶。
（2）培养基：LAB培养基。
（3）器皿：无菌试管，无菌培养皿，无菌移液管（1、5、10ML）（4）其他：无菌生理盐水，是管家，记号笔，超净工作台等。
方法和步骤1.配置培养基：先配制LAB培养基加热融化，并置于50度恒温烘箱保温备用。
2.编号：取4支试管，以此编号为1、2、3、4，再取16个培养皿，分别编号为1、2、3、4，每个编号下四个培养皿，作为重复。
留下一个培养皿作为对照。
3.分装稀释液：在超净工作台中用5ml移液管分别称取4.5ml无菌生理盐水于以上编号的试管中。
4.稀释菌液：每次稀释待测菌的原始样品时，现将其摇匀，然后用1ml无菌移液管在待稀释的原始样品中来回吹洗数次，再精确移取0.5ml菌液至1号试管中。
然后另取1ml试管，以同样方式，在1号试管中来回吹洗数次，，并精确移取0.5ml至2号试管中，直至稀释至4号试管为止。
5.转移菌液：分别用1ml无菌移液管吸取1、2、3、4号试管中各0.2ml，加至相应编号的无菌培养皿中。
6.到培养基液：菌液倒入后立即倒上熔化并冷却至50度的LAB培养基。
7.摇匀平板：将菌液和培养基充分摇匀，并静之冷凝。
8.倒置培养：待平板凝固后，倒置于37度恒温培养箱中培养。
9.计菌落数：培养48小时后，选取菌落数量适当的培养皿，计算每个皿中的菌落数，并进行记录。
10.清洗器皿：将计数后的平板在沸水中煮沸，清洗后晾干。
结果记录并计算1-1号培养皿菌落数1218个1-2号培养皿菌落数1199个1-3号培养基菌落数737个1-4号培养基菌落数1039个平均菌落数1048.25个计算可得每毫升艾草液含有的活菌数是52413个。
实验四-微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
四、菌种衰退的原因
▪ 基因突变－－主要原因 ▪ 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 ▪ 2、表型延迟造成菌种衰退 ▪ 3、质粒脱落导致菌种衰退 ▪ 连续传代－－加速衰退 ▪ 不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退
五、菌种衰退的防止
▪ 控制传代次数 ▪ 创造良好的培养条件 ▪ 利用不易衰退的细胞移种传代 ▪ 采用有效的菌种保藏方法 ▪ 讲究菌种选育技术 ▪ 定期进行分离纯化，测试性能
干燥或较干燥 小而紧密
丝状交织，紧密 细而均匀
干燥 大而疏松或大而致密
丝状交织 粗而分化
菌落透明度
菌落与培养 基结合程度
菌落颜色 参 考 菌落正反面 特 颜色的差别 征
菌落边缘
细胞生长速度
气味
透明或稍透明 不结合 多样 相同
一般看不到细胞 一般很快
一般有臭味
稍透明
不透明
不结合
牢固结合
单调，一般呈乳脂或矿 烛色，少数红色或黑色
实验四 微生物的菌落形态观察、 平板菌落计数及菌种保藏
目的要求
1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态 特征，并加以区分。
2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，
并接种于斜面，进一步加强无菌操作技 术。 4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见 方法。
实验内容
▪ 微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、 霉菌、酵母菌——放在后面介绍）
做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 （4）其它：如Simplate即用胶，改良MPN产
品。
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
aColyte自动菌落计数仪
螺旋平板原理
接种针往外移
动同时自动将 样品稀释1000 倍。
平板菌落计数法
平板菌落计数法平板菌落计数法农资101 1031240125 周瑶实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验方法1、样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml 无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
平板菌落计数法实验报告
平板菌落计数法实验报告摘要：平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，用于测定液体样品或表面样品中微生物的数量。
本实验旨在通过平板菌落计数法确定给定液体样品中的微生物菌落的数量。
实验过程包括制备不同稀释度的样品，将样品平铺在琼脂平板上，培养并计数菌落数量。
实验结果显示不同稀释度的样品中菌落的数量，从而计算出原液中微生物的浓度。
材料和方法：1. 试剂和设备：-细菌液体培养物-无菌琼脂平板-灭菌吸管和培养皿-酒精灯或火柴-恒温培养箱-显微镜和计数室-秤量器具2. 实验步骤：1. 准备一系列不同浓度的样品，通过逐步稀释原液来获得不同稀释度的样品。
2. 取一块无菌琼脂平板，将其置于消毒柜中加热至溶化状态。
3. 将一份稀释液均匀地倒入平板上，并轻轻旋转平板，使液体均匀覆盖整个平板表面。
4. 等待琼脂凝固，将平板盖上，反转后放置在恒温培养箱中。
5. 在适当的培养温度下培养一段时间（通常为24至48小时）。
6. 取出培养好的平板，使用显微镜和计数室对菌落进行计数。
7. 根据计数结果和稀释倍数计算原液中的菌落数量和浓度。
结果：以下是实验结果的示例表格：讨论：通过平板菌落计数法，我们成功确定了给定液体样品中的微生物菌落的数量。
实验结果表明，随着稀释倍数的增加，菌落数量逐渐减少，原液中的微生物浓度也相应减少。
这种计数方法的优点是简单易行，但也存在一些限制，例如某些微生物可能不适合在琼脂平板上生长，或者某些微生物形成聚集菌落，使得计数困难。
结论：平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，通过稀释液体样品、平铺在琼脂平板上、培养和计数菌落数量，可以确定原液中微生物的浓度。
这种方法可以应用于食品、环境和医药等领域的微生物数量测定，为微生物研究和质量控制提供了重要的手段。
平板菌落计数法计算公式 例题
平板菌落计数法计算公式例题平板菌落计数法计算公式例题一、引言平板菌落计数法是微生物学实验室中常用的一种微生物计数方法，通过在琼脂平板上培养微生物，并根据菌落的形成情况来进行微生物数量的估算。
在本文中，我将介绍平板菌落计数法的计算公式，并通过一个具体的例题来加深理解。
二、平板菌落计数法的计算公式在进行平板菌落计数法时，通常使用以下计算公式来计算微生物的数量：N = n/d * 1/V其中，N 代表菌落总数（CFU/g或CFU/mL）n 代表在某一平板中被计数的菌落数d 代表对数稀释倍数V 代表每次接种的体积（mL）这个计算公式是通过对每个平板上的菌落数进行统计，并根据稀释倍数和接种体积来进行微生物数量的推算。
三、例题分析假设我们在实验室中进行了一次细菌计数实验，以确定某一食品样品中的细菌数量。
我们首先进行了系列的稀释，并将不同稀释倍数的样品接种在琼脂平板上。
在我们观察到的一张平板上，我们发现了以下菌落数：- 在1:10稀释倍数下，菌落数为30- 在1:100稀释倍数下，菌落数为18- 在1:1000稀释倍数下，菌落数为5假设每次接种的体积为1mL，则根据上述数据，我们可以进行如下的计算：N = (30/10) * 1/1 + (18/100) * 1/1 + (5/1000) * 1/1= 3 + 0.18 + 0.005= 3.185根据计算，我们可以认为在此食品样品中的细菌数量为3.185 CFU/mL。
四、总结与回顾通过这个例题的分析，我们加深了对平板菌落计数法的理解。
通过对不同稀释倍数下的菌落数进行计数，并根据计算公式进行推算，我们可以较为准确地确定样品中微生物的数量。
在实际操作中，我们需要注意稀释倍数和接种体积的准确控制，以避免出现较大误差。
五、个人观点和理解平板菌落计数法作为一种常用的微生物计数方法，在实验室中具有重要的应用价值。
通过对菌落的形态和数量进行观察，我们可以快速、准确地了解样品中微生物的数量，为食品安全、药品生产等领域提供了有力的数据支持。
平板菌计数法实验报告
一、实验目的1. 熟悉平板菌落计数法的基本原理和操作步骤。
2. 掌握使用平板菌落计数法测定样品中微生物数量的方法。
3. 学会计算样品中微生物数量。
二、实验原理平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，其基本原理是：将待测样品经过一系列稀释后，取一定量的稀释液接种到固体培养基上，在适宜的温度和条件下培养，通过观察和计数菌落，即可计算出样品中的微生物数量。
三、实验材料1. 样品：某食品样品。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3. 仪器：无菌平皿、无菌移液管、恒温培养箱、电子天平、酒精灯、镊子、试管等。
4. 试剂：无菌生理盐水、无菌水、75%酒精、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸等。
四、实验步骤1. 样品处理：称取10g样品，加入90ml无菌生理盐水，充分振荡混匀，制成1:10的样品稀释液。
2. 稀释：取1ml样品稀释液，加入9ml无菌生理盐水，制成1:100的样品稀释液；取1ml1:100的样品稀释液，加入9ml无菌生理盐水，制成1:1000的样品稀释液；以此类推，制成1:10,000、1:100,000的样品稀释液。
3. 接种：用无菌移液管取0.1ml1:100,000的样品稀释液，加入已灭菌的平皿中，均匀涂布。
4. 培养基制备：称取25g牛肉膏蛋白胨培养基，加入750ml蒸馏水，煮沸溶解，调节pH值至7.2-7.4，分装到灭菌的试管中，每管10ml，高压灭菌。
5. 培养基冷却：待培养基冷却至45-50℃时，倒入无菌平皿中，制成平板。
6. 培养与观察：将接种好的平板倒置放入恒温培养箱中，培养48小时。
7. 计数：选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，计算菌落数。
8. 结果计算：样品中微生物数量 = 计数平板菌落数× 稀释倍数× 接种量。
五、实验结果与分析1. 实验结果：本次实验共制备了1:10,000、1:100,000的样品稀释液，分别接种到平板中，培养48小时后，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验四微生物平板菌落计数法
一、实验目的
学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。
二、实验原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞,所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低,为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（ｃｆu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁,结果需要培养一段时间才能取得,而且测定结果易受多种因素的影响,但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水(包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
三、实验器材
1 . 菌种：酵母菌。
2 ．培养基：ＹEB培养基。
3 ．仪器或其他用具: 1ml 无菌吸管,无菌平皿,盛有４.５ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、实验步骤
1 ．编号
取无菌平皿９套,分别用记号笔标明 10-4、10－5、 1０-6(稀释度）各 2 套，
另取 6 支盛有 4．5ml 无菌水的试管，依次标是１０-1、１０-2、 10-3、 10-4、
１0-5、
10－6。
2 . 稀释
用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液(待测样品)，精确地放
０.5ml 至 1０-1的试管中，此即为 10 倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将 10-1试管置试管振荡器上振荡,使菌液充分混匀。
另取一支 1ml 吸管插入10-１
试管中来回吹吸菌悬液三次,进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
用此吸管吸取 1０－１菌液1ml ，精确地放 0.5ml 至 10－２试管中，此即为１０0 倍稀释。
······其余依次类推。
放菌液时吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液,否则稀释不精确，结果误差较大。
3 ．倒平板法:1）取样。
用三支１ml 无菌吸管分别吸取10-4、10-5和 10-6的稀释菌悬液各1ml ，对号放入编好号的无菌平皿中,每个平皿放 0.2ｍl 。
不要用１ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
2）倒平板。
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45 ℃左右的LB培养基约15 毫升 / 平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀,而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
由于细菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加入到培养皿后,应尽快倒入融化并已冷却至４5 ℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起,影响计数。
3）待培养基凝固后,将平板倒置于 37 ℃恒温培养基中培养。
4.涂布法:涂抹平板计数法与倒平板法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0．1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。
再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图２２-３)，每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。
在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲。
将涂抹好的平板平放于桌上20—30ｍiｎ，使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数。
5 ．计数
培养 4８h 后,取出培养平板,算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算:
每毫升中菌落形成单位（ cfu ) = 同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数× 5
一般选择每个平板上长有 3０~３０0 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适,同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。
实际工作中同一稀释度重复三个对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。
由 1０-4、
10-5 和 10－6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后,所出现的平均菌落数在5０个左右为好,否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
五、实验结果
将培养后菌落计数结果填入下表：
六、思考题
( １ )为什么融化后的培养基要冷却至 45 ℃左右才能倒平板？
( 2 ）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么？
( ３）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
（ 4 ）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?
( ５ )用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间( 4８h ）后观察结果?。