平板菌落计数法操作步骤

平板菌落计数法

一、目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

二、基本原理

平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位。

该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测。

三、器材

大肠杆菌悬液，LB琼脂培养基，1mL、5mL无菌吸管，无菌平皿，无菌水，无菌试管，试管架和记号笔等。

四、操作步骤

1、编号

取无菌平皿9套，分别标明为10-4、10-5、10-6各三套，另取6支无菌试管分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2、稀释

用1mL无菌吸管吸取1mL已充分混匀的大肠杆菌菌悬液，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释，将多余的菌液放回原菌液中。

将10-1试管充分振荡、混匀。另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌液三次，进一步将菌体分散、混匀。动作不要太猛太快，吸时插入，吹时提出，再用此吸管吸取10-1菌液1mL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释，依次类推，

3、取样

用三支1ml无菌吸定分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各1mL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL

4、倒平板

尽快向上述盛有不同稀释菌液的平皿中倒入融化后冷却至45度的LB培养基约15-20ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。

5、培养

倒置于37度培养箱中培养48小时，

6、计数

算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算；

每毫升中菌落形成单位（cfu）= 同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

五、实验报告

1、结果

将培养后菌落计数结果填入下表：

2、思考题

(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

(3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？

(4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。