FITC蛋白标记方法
fitc-异硫氰酸酯标记蛋白原步骤
fitc-异硫氰酸酯标记蛋白原步骤
FITC-异硫氰酸酯（FITC-isothiocyanate）标记蛋白原的步骤如下：
1. 准备所需材料：FITC-异硫氰酸酯、蛋白原、缓冲溶液、保护剂、质量控制溶液等。
2. 操作前准备：将FITC-异硫氰酸酯溶解在合适的溶剂中，制备FITC-异硫氰酸酯的工作溶液。
3. 蛋白原和FITC-异硫氰酸酯反应：将蛋白原加入含有FITC-异硫氰酸酯的工作溶液，使其反应一段时间（通常为1-2小时），在适当的条件下进行反应。
4. 反应终止：加入适当的保护剂或溶液终止反应，以保护蛋白原的活性和稳定。
5. 蛋白原的纯化：使用适当的方法将标记后的蛋白原从其他非特异性反应产物中纯化出来，常见的方法包括凝胶层析、亲和层析等。
6. 质量控制检测：使用质量控制溶液对标记后的蛋白原进行检测，以确保其标记效果和质量符合要求。
需要注意的是，具体的步骤会根据实验设计和蛋白原的特性而有所差异，以上仅为一般标记步骤的概述。
在进行实验前应仔
细阅读相关文献或标签试剂盒的说明书，并严格按照实验室的操作规范进行操作。
FITC标记蛋白
FITC标记蛋白基本原理：蛋白质分子的赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC发生亲核反应，形成硫脲连接而共价结合，形成的偶联物的稳定性很好。
该偶联反应在pH 9.8条件下进行。
试剂及仪器：待偶联蛋白质，PBS，FITC，叠氮钠，碳酸氢钠缓冲液：25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3缓冲液pH9.8 (新鲜配制录)电磁搅拌器铝铂操作步骤：用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光，4℃搅拌过夜；上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。
其间至少更换PBS液三次，直致480nm 的吸收为零；加入0.5g/L 的叠氮钠。
此后，结合物在4℃避光保存，或分装后在－2０℃冻存。
荧光偶联质量的检测：用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。
或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定：取结合物液0.2ml，加PBS 2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，查FITC标志曲线得其浓度μg/ml值，按IgG的消光系数（mg/ml约A280 1.2）,可计算其F/P值，即每mg抗体所标记的μgFITC的比值，可以此鉴定及比较各批标记物的质量。
实验要点及说明：偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）；FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。
此比值的范围应为0.3－1.0；FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰。
荧光素FITC标记抗体方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
FITC标记蛋白质
FITC标记蛋白质Product Numbers:Synonym: FITCAppearance: yellow powder Storage Temperature 2-8 °CMolecular Formula: C21H11NO5S Molecular Weight: 389.4Excitation: λmax = 495 nm Emission: λmax = 525 nmFluorescein isothiocyanate (FITC，异硫氰酸荧光素) is widely used to attach a fluorescent label to proteins via the amine group. The isothiocyanate group reacts with amino terminaland primary amines in proteins. It has been used for the labeling of proteins including antibodies and lectins.FITC-N=C=S + N-H2-protein →FITC-NH-S-C-N-H-proteinPreparation InstructionsFITC is tested for solubility and solution appearance at 1 mg/mL in acetone to give a clear yellow solution. It is soluble in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) at 5 mg/mL. It is soluble in water at less than 0.1 mg/mL in water, at 20 mg/mL in ethanol and at 9 mg/mL in 2-methoxyethanol. An organic solvent for stock solution is advised, since FITC decomposes in water. FITC is diluted in basic buffer for coupling procedures immediately prior to use.Storage/StabilityThe products are light-sensitive, and should be stored dry and in the dark at 2 °C to 8 °C.Procedure of Labeling Protein with FITC1.Preparation before experiment:1)配100mL，0.1M PH=8.5的SB缓冲液(0-5℃保存，且不超过一周，最好现配现用)；2)准备好A,B,C,D四个石英比色皿；3)取一小容量瓶，事先用锡箔纸将其完全包住以避光；4)用超纯水注满D=15mm，L=300mm的柱层析分离吸附柱，过夜浸泡，同时检测其是否漏液，第二天再用PBS浸泡7-8h；5)用DIW浸泡葡聚糖Sephadex G-50过夜(1g Sephadex G-50配5mLDIW)，使其溶胀，打开孔状结构；而后将DIW倒掉，注入适量PBS(PH=7.4)，用锡箔纸盖好防灰，4℃保存；注：(1) Sephadex G-50量可以过多，过完柱层析分离吸附柱后剩余部分可加入0.02%(m/v)NaN3，防止细菌，保存于4℃冰箱中；(2) Sephadex G-50第一次配好后可以反复使用多次，但应做相应后处理(见后)；(3) Sephadex G-50分离范围：1000-30,000(分子量)，2.计算Protein中游离-NH2，配制1.0mg/mL Protein/SB蛋白溶液：BSA, Fraktion V Mw=67000Da, Arg 26个; lys 60个;20mg BSA; 2mLSB(0.1M PH=8.5)；游离-NH2：n1=20×0.001g×(26+60)/( 67000g.mol-1) =2.57×10-5mol；溶于小容量瓶中(外包锡箔纸避光处理)，加搅拌子搅拌，使其完全溶解；注：组成蛋白质的20中氨基酸中，仅Arg，lys在侧链上有游离的-NH2。
FITC蛋白标记方法
F I T C蛋白标记方法 Revised by Petrel at 2021
F I T C蛋白标记方法
1.溶液准备：0.15mol/LNaCl溶液，配法，称取8.775gNaCl溶解于
1L水中，
0.15mol/LNaHCO3-Na2CO3,PH9.0缓冲液，配法，取（1.59%）
Na2CO310ml，（1.26%）NaHCO390ml,调PH到9.0
2.蛋白溶解液：按V0.15mol/LNaCl：V0.15mol/LNaHCO3-Na2CO3=9:1，溶解蛋白，使蛋白的终浓度为10mg/ml。
3.加入荧光素，加入的荧光素的质量按m
蛋白：m荧光素=50~80mg:1mg,称取完成后加入事先配好的蛋白溶解液中，于4℃生化培养箱中，摇床混匀过夜。
注意加入荧光素后需要避光。
4.将混匀后的溶液转移到Millpore超滤管中，超滤管中滤膜可以拦截分子量大于3KD的分子，配平后以5000g的转速于日立高速离心机（型号）
离心至无荧光素滤出为止。
大约需离3次，每次离心需2-3h。
5.离心结束后，将超滤管中的标记液倒入用锡箔纸包裹的塑料管中，不加叠氮钠于4℃保存。
参考文献：MMP-
3ContributetoNigrostriatalDopaminergicNeuronalLoss,BBBDamag e,andNeuroinflammationinanMPTPMouseModelofParkinson’sDisea se.。
抗体FITC标记操作流程记录
抗体FITC标记操作流程记录1.准备实验材料和试剂：-使用双蒸水去离子水做媒介，保证无杂质。
-准备用于标记的FITC抗体和FITC标记试剂盒。
-合适的缓冲液（例如PBS）用于稀释抗体和洗涤样品。
2.准备样品：-如果需要标记的是细胞，将细胞培养在合适的培养基中，并将其接种在预处理好的玻片上。
-如果需要标记的是组织切片，将组织固定在适宜的固定剂中，切割成适当的厚度。
3.处理样品：-对于细胞样品，进行适当的固定和渗透，以保持细胞形状和抗原结构的完整。
-对于组织样品，进行适当的脱水、透明化和抗原修复等步骤。
4.准备标记试剂：-按照标记试剂盒的说明书，将FITC标记剂和稀释液按照特定比例混合，并充分搅拌均匀。
5.标记抗体：-将抗体与FITC标记试剂混合，然后在室温下孵育一段时间（通常为30-60分钟）。
-注意避免直接阳光照射，以免造成荧光剂失效。
6.洗涤样品：-使用PBS或合适的缓冲液对细胞或组织样品进行洗涤，以去除未与抗体结合的游离FITC。
7.孵育样品：-将标记好的抗体溶液滴加在样品上，使其充分覆盖样品表面，并在室温下孵育一段时间。
-孵育时间通常为1-2小时，以确保抗体与抗原结合充分。
8.再次洗涤样品：-使用PBS或合适的缓冲液对样品进行再次洗涤，以去除未与抗体结合的游离FITC。
9.固定样品：-对于细胞样本，使用适当的固定剂固定细胞并保存形态。
-对于组织切片，将标记好的样品用适当的固定剂进行固定。
10.显微观察和图像获取：-将标记好的样品放在显微镜下观察。
-使用适当的荧光滤光片来选择FITC的激发和发射波长，并记录图像。
11.数据分析：-根据显微观察到的荧光信号，分析抗体FITC标记的结果。
-可以通过计算荧光强度、分析荧光背景等进行数据分析。
12.结果的记录和表示：-将观察到的结果记录下来，并通过图表或图片等形式表示。
13.清洁和处理垃圾：-将使用过的试剂瓶、玻片和其他实验用具进行清洁和处理。
-将废弃物按照规定的程序进行垃圾处理，以确保实验室的安全和环境保护。
FITC标记蛋白质的方法
FITC标记蛋白质的方法FITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用于标记蛋白质的荧光染料。
FITC 标记蛋白质的方法主要包括化学共价结合和生物亲和结合两种。
化学共价结合是FITC标记蛋白质最常用的方法之一、该方法利用FITC分子中的异硫氰基与蛋白质中的氨基酸侧链上的羟基、胺基、硫醇基等反应，形成稳定的共价键。
常用的化学共价结合方法有直接标记和间接标记两种。
直接标记方法是将FITC直接与蛋白质反应制备成FITC-蛋白质共价偶联物。
该方法简单快速，但容易引起蛋白质的损伤和聚集，从而影响蛋白质的功能和结构。
间接标记方法则采用二步法，在第一步中，将FITC标记到与蛋白质特异结合的二抗上，形成FITC-二抗共价偶联物；在第二步中，该FITC-二抗与蛋白质发生特异性的抗原-抗体反应，从而实现FITC标记蛋白质的目的。
该方法操作简单，不容易损伤蛋白质的结构和功能，因此在很多领域中被广泛应用。
除了化学共价结合，生物亲和结合也常用于FITC标记蛋白质。
生物亲和结合方法利用具有亲和性的结合分子在非共价方式下结合FITC和蛋白质，形成等效标记。
常用的生物亲和结合方法有亲和标记系统、酶标记系统和金标记系统。
亲和标记系统是一种利用富含半化合金属离子的亲合树脂，在存在FITC和蛋白质的条件下实现FITC标记的方法。
该方法在选择亲合树脂时需要考虑其对蛋白质的亲和性、将FITC与蛋白质结合后的稳定性以及标记后的蛋白质能否保持其结构和功能。
酶标记系统是一种利用酶标记物将FITC标记到蛋白质上的方法。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和逆转录酶等。
该方法对于需要进一步进行酶活性检测或者需要与其他酶标记物共同使用的试验有很大的应用价值。
金标记系统是一种利用金纳米颗粒将FITC标记到蛋白质上的方法。
金纳米颗粒具有很高的表面增强拉曼散射（SERS）信号，可以增加FITC标记物的检测灵敏度。
该方法可以应用于免疫组化检测、免疫荧光显微镜等领域。
人白蛋白- FITC使用说明
人白蛋白-FITC使用说明
货号：SF007
规格：0.1mL/0.3mL/0.5mL/1.0mL
保存：-20℃保存，有效期至少一年。
产品说明：
免疫血清经过亲和层析的方法纯化出高纯度的IgG，采用直接标记法，将异硫氰酸荧光素（FITC，绿色荧光）共价交联到抗体IgG分子的赖氨酸基团上，并经过纯度、蛋白含量、FITC浓度及效价鉴定，为特异、灵敏和稳定的优质产品。
抗体浓度：14mg/mL
FITC浓度：120μg/mL
使用方法：客户需要根据自己的实验摸索出最佳的稀释倍数，可用PBS(0.01mol/L,pH7.4)稀释。
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FITC蛋白标记方法
1.溶液准备：0.15mol/L NaCl溶液，配法，称取8.775gNaCl溶解于
1L水中，
0.15mol/L NaHCO3-Na2CO3,PH9.0缓冲液，配法，取（1.59%）Na2CO3
10ml，（1.26%）NaHCO3 90ml,调PH到9.0
2.蛋白溶解液：按V0.15mol/L NaCl：V0.15mol/L NaHCO3-Na2CO3=9:1，溶解蛋白，使蛋白的终浓度为10mg/ml。
3.加入荧光素，加入的荧光素的质量按m蛋白：m荧光素=50~80mg:1mg,称取完成后加入事先配好的蛋白溶解液中，于4℃生化培养箱中，摇床混匀过夜。
注意加入荧光素后需要避光。
4.将混匀后的溶液转移到Millpore超滤管中，超滤管中滤膜可以拦截分子量大于3KD的分子，配平后以5000g的转速于日立高速离心机（型号？）离心至无荧光素滤出为止。
大约需离3次，每次离心需2-3h。
5.离心结束后，将超滤管中的标记液倒入用锡箔纸包裹的塑料管中，不加叠氮钠于4℃保存。
参考文献：MMP-3 Contribute to Nigrostriatal Dopaminergic Neuronal Loss,BBB Damage, and Neuroinflammation in an MPTP Mouse Model of Parkinson’s Disease.。