免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程

一、实验原理与意义

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通

过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧

光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋

白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材

微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、

计时器和通风橱等。

三、试剂配制

1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml

0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸

水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；

B. 0.2

M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷

却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。

4. 5％羊血清或封闭血清，用PBS 稀释。

5. 含0.03％H 2 O 2 的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30%

H 2 O 2 ＋95 ul PBS。

6. 一抗、二抗均用PBS 稀释。

7. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。

8. 苏木精染液：

四、操作步骤

1 、脱蜡、水化

1) 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；

2) 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；

3) 95% ethanol 2 minutes；

4) 80% ethanol 2 minutes；

5) 70% ethanol 2 minutes；

6) distilled water:5 min；

7) PBS 洗3 次×3 min。

2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶

8) 用封闭通透液浸润切片30 min（RT 避光）。配法是用预热40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H 2 O 2 。

9) PBS 溶液洗3 次×3 min。

3、抗原修复暴露抗原决定族

10) 切片放入0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min 至沸腾后，再加热约6 min×4 次，每次间隔补足液体，防止干片。

4、封闭非特异性蛋白

11) PBS 溶液洗3 次×3 min；

12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴

入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；

5、一抗孵育

13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1 小时，然后4 度过夜，从冰箱中取出需

37 ℃复温45 min。

6、二抗孵育

14) 将一抗倒掉并用PBS 洗5 min×5 次；

15) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min （回收）。

16) 用PBS 洗5 次×5 min；

7、SP 反应

17) 加入SP 后放入37 度烤箱中30 min。

18) 用PBS 洗5 次×5 min；

8、显色

19) 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光）（1:20 储备液）：5 ul 20×DAB ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS。1%DAB 储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 ℃保存。

9、复染、脱水、透明、封片

20) 用PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗5 min；

21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s 后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS 返蓝5 min。

22) 脱水：50% ethanol 1-2 min，

70% ethanol 1-2 min

95% ethanol 1-2 min；

95% ethanol 1-2 min；

100% absolute ethanol: (1-2) min；

100% absolute ethanol: (1-2) min。

23) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min

24) 封片：中性树胶。

五、注意事项

1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。

2. DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4 度过夜。

4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。

5. 片子着色不均匀的原因如下：

①脱蜡不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；