动物病理组织免疫组化制片操作规程

动物病理组织免疫组化制片操作规程

1、取材选材部位以病灶与正常组织交界处的组织标本为好，取材要完整，要尽可能注意到整个器官的结构特点。大小一般是1cm×1 cm×0.5 cm为宜。

在夹取组织时不要用力压、挤、揉等以免损坏组织。

2、固定以10%中性福尔马林固定液（固定液的量应为组织块的10-20倍）固定时间24-36小时。组织长时间固定，固定液中的福尔马林含有的杂质会产生一种酸，影响核的染色，整个组织显得非常陈旧。

3、全自动脱水机：包括脱水、透明、浸蜡等步骤

3.1、脱水组织经固定后，内含大量水分，须除尽水分才利于透明、浸蜡。常用酒精为脱水剂，逐级提高酒精浓度，以防组织过度收缩、变脆或脱水不完全而影响制片效果。脱水一般在室温下进行，由60%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精I、100%酒精II组成。组织块在酒精中时间不宜过长，否则组织块容易变硬。

如切片后的蜡块中央呈灰白粗糙而不透亮，放置一段时间后蜡块中央出现一陷窝，此即表明组织脱水不够彻底，组织面暴露后水分蒸发，蜡块中央收缩形成陷窝，严重时难以切出完整切片。注意定时更换新的脱水剂，一般在使用到1500个脱水盒(含组织块)后即可考虑更换脱水液。

3.2、透明在室温下，组织块采用二甲苯或TO透明剂中进行透明。一般透明剂分为I、II两个试剂缸。组织在二甲苯或TO透明剂中贮留时间必须严格掌握，时间稍长，则组织脆硬易碎；时间过短，石蜡不易渗透进去，使浸蜡不完全。3.3、浸蜡恒温杯内温度应调至58-60℃为宜，使石蜡熔化完全。石蜡分为I、II两个缸。尽量控制组织块在石蜡中的浸泡时间，时间过长组织易碎；时间过短，石蜡未渗透进去，组织不能切片。

附：自动脱水机使用操作规程

4、包埋将温箱中熔化好的石蜡倒进包埋框内，迅速用热镊子将组织放入包埋模具内，将要切的面朝下并摆正位置，多块的小的组织应集中放在一起，处于一个水平面上，管状组织如血管、气管、肠道等须立起来包埋，然后压上塑料盒，再注入少量的石蜡液，将其移放室温下一定时间后，再转移至冰冻台上冰冻固定，待其蜡块完全凝结后，取出蜡块，修切去抱抱盒周边浓度余蜡。

5、在普通载玻片上涂一层合适的组织粘附液，或使用免疫组化专用载玻片。

6、切片在切片前，须对蜡块进行修切，如此才能适合于切片。切片机装上锋利的切片刀(刀的斜度为5度)，调节器调在4-6微米厚度，调整蜡块切面使之与刀口平行。左手平持毛笔，右手旋动切片机把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，切片切取一定长度之后，用毛笔或镊子轻轻取起石蜡切片，平铺于摊片机恒温水里，使石蜡切片展平。

7、裱片摊烘烤片机内水温保持在40-45℃，将切片光泽面向下铺于温水上。等切片展开后用清洁的载玻片从水中捞出，拨正位置，把贴好切片的载玻片放在摊烘烤片机的烤片板上，烤干水分。

8、烤片把贴有切片的载玻片直立放在染片架上，送入59~63℃左右的温箱中烘烤4~6小时，直到蜡片融化，组织片成半透明状。注意烤片温度的控制。

9、二甲苯或TO透明剂脱蜡，降梯度酒精洗脱，最后自来水冲洗。

10、将1500mL抗原修复液放入不锈钢高压锅中加热直至沸腾，盖上锅盖，但不盖紧、不关闭加压阀。

11、将染色架放入高压锅内，让切片完全浸没再修复液中，盖上锅盖，关闭加压阀。

12、计时月6min。关闭电源，打开加压阀，并于其上加盖一湿毛巾。高压蒸汽未放完严禁打开锅盖。

13、压力正常后，打开锅盖，取出高压锅内胆，放入预放好的冷水中冷却。

14、取出染色架，立即放入自来水中冲洗。

15、PBS冲洗。

16、3%H2O2液阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10min。

17、流水冲洗，PBS液洗，擦干切片组织周围表面水分，PAP笔划圈；

18、滴加稀释的正常血清孵育10min。

19、用最佳稀释浓度的一抗工作液孵育，室温或37℃下2~3小时。PBS冲洗。

20、滴加生物素标记的羊抗兔/鼠二抗工作液，室温下孵育20min。PBS冲洗。

21、滴加HRP标记的链霉亲和素(三抗)，室温下孵育20min。PBS冲洗。

22、DBA显色工作液孵育3~10min。PBS冲洗。

23、苏木素复染，脱水、透明盒封片。

结果：阳性物质在胞（浆）内呈棕黄色细颗粒状。

免疫组织化学染色结果判断：

细胞相应部位（细胞核、细胞浆、细胞膜等）出现黄色反应为阳性，以阳性对照成份阳性而检测部分无反应为阴性。根据显色强度和阳性细胞数两项指标判断阳性等级。按显色强度分为无色、淡黄，黄色、棕黄色，分别计为0、1、2、3分；按阳性细胞占同类细胞的比例分为0、<1/3、1/3~2/3、>2/3，分别计为0、1、2、3分。将两项积分相乘，确定0分为阴性，1~3分为弱阳性，4~6分为中等阳性，9分为强阳性，分别计为—、+、++、+++。

注意事项：①操作过程中组织必须保持在湿润状态，不能干燥；②所加试剂以完全覆盖组织为度。