大肠杆菌基因组测序
30株大肠杆菌的泛基因组学特征分析
了３ ０株 已经 完成测 序 的大肠杆 菌 的基 因、基 因组 成及其 进 化特征 ， 结果 表 明核 心基 因只 占 每株 大肠 杆菌全 据 部 基 因数 目的 ５％左右 ，而平均 每个 菌株 有 １６ 特 有基 因， 果表 明 随着 更 多大肠 杆菌 菌株 的基 因组被 测序 ， ０ ４个 结
将 会不间基 因的保 守性 与基 因的 ＧＣ含 量 以及选 择压 力
之 间的关系 ， 现越保 守 的基 因其 Ｇ 含 量 变化 范围越 窄，同 时在 进化 中受 到 的选择压 力也越 大 。这 些结果 将 发 Ｃ 有 助 于深 入 了解 大肠 杆 菌基 因组 的进 化特 征及 其 基 因组 成 的动 态 变化 ， 为 预 防和控 制 由致 病性 大肠杆 菌 ５ 并 ｌ
Ｇｕ ｎ ｚ ｏ ０ ０１ Ｃｈｉ ａ ａ ｇ ｈ ｕ ５１ ３ ， ｎ；
２ Ｇｒｄ ａｅＵ ｉ ｒｉ ｈ ｈｎｓ ｃ ｄｍ ｃｅ ｃｓＢｅ＇ｇ １０ ４ ， ｈｎ ． ａ ｕ ｔ ｎｖ ｓｔｏ ｅＣ ｉｅｅ ａ ｅ ｙｏ ｉ ｅ， ｏｎ ０ ０ ９ Ｃ ｉａ ｅ ｙ ｆｔ Ａ ｆＳ ｎ ｉ
Ａｂｓ ｒ ｃ ： Ａ ａ — ｅ ｏ ｅｄ ｓ ｒ ｅ ｈ ｕ ｌｃ ｍｐｅ ｎ ｆｇ ｎ ｓｉ ｐ ｃｅ． ｔｉ ｕ ｅｓｔｏ ｌ ｔｅｇ ｎ ｓｉ ｌ ｔｅ ｔａ ｔ ｐ ｎ ｇ ｎ ｍ ｅ ｃｉ ｓｔｅ ｆｌ ｏ ｌｍｅ ｔ ｅ ｅ ｎ ｓ ｅ ｉｓ Ｉ ｓａ ｓｐ ｒｅ ｆａｌ ｈ ｅ ｅ ｎ ａｌ ｈ ｂ ｏ
ｉ ｄ ｖ ｄ ａ ｓｏ ｅ ｉ ｓ ｗｈ ｃ ｏ ｏ ｅ ｆ ｃ ｒ ｅ ｏ ’ ｏ ｔ ｉ ｉ ｇ ｇ ｎ ｓｐ ｅ ｅ ｔｉ ｌ ｉ ｄ ｖ ｄ ａｓ ａ ｄ ａ‘ ｉｐ ｎ ａ ｎ ｉ ｉ ｕ ｌ ｆａｓ ｃ ｅ ， ｉ ｈ ｉ ｃ ｍｐ ｓ ｄ ｏ ｏ ｅｇ ｎ ｍｅ ｃ ｎ ａｎ ｎ ｅ ｅ ｒ ｓ ｎ ａ ｌ ｎ ｉ ｉ ｕ ｌ， ｎ ｄ ｓ ｅ ｓ － ｐ ｓ ａ‘ ｎ ｂ ｅ ｇ ｎ ｍｅ ｃ ｎ ａｎ ｎ ｅ ｅ ｒ ｓ ｎ ｎ ｙ ｉ ｏ ｎ ｉ ｉｕ ｌ ｎ ｎ ｉ ｉ ｕ ｌｓ ｅ ｉ ｃ ｇ ｎ ｓ Ｆ ｏ ｐ ｎ ｇ ｎ ｍｅ ｓｇ ｔ ３ ｌ ｅ ｏ ’ ｏ ｔ ｉ ｉ ｇ ｇ ｎ ｓｐ ｅ ｅ ｔｏ ｌ ｓ ｍｅ ｉ ｄ ｖ ｄ ａ ｓａ ｄ ｉ ｄ ｖ ｄ ａ —ｐ ｃ ｆ ｅ ｅ ． ｒ ｍ ａ － ｅ ｏ ｉ ｈ ， ０ ｎ ｉ ｉ ｓ ｅ ｅ ｏ ｓｆ ｍ ｃ ｅ ｉｈ ａ ｃ ｌ ｗｅ ｅｅ ｌ ｙ ｄ ｔ ｎ ｌｚ ｈ ｉ ｅ ｅ ａ ｄ ｇ ｎ ｍ ｏ ｏ ｉ ｏ ｓａ ｄ ｅ ａｕ ｔ ｆ ｉｈ ｄ ｇ ｎ ｍｅ ｏ Ｅｓ ｈ ｒｃ ｉ ｏ ｉ ｒ ｍｐ ｏ ｅ ｏ ａ ａｙ ｅｔ ｅｒｇ ｎ ｎ ｅ ｏ ｅｃ ｍｐ ｓｔ ｎ ｎ ｖ ｌ ａｉ ｎ ｉ ｎ ｒ ｉ ｏ ｎ ｔ ｉ ｔ ｄ ． ｈ ｅ ｕ ｔ ｉ ｄ ｃ ｔ ｄ ｔ ａ ｅ ｃ ｒ ｅ ｅ ｃ ｏ ｎ ｅ ｏ ｂ ｕ ０ ｏ ｅ ｔｔ ｌ ｕ ｅ ｆｇ ｎ ｓ ｗｈ ｌ ｂ ｕ ４ ｈ ｓｓ ｙ Ｔ ｅｒ ｓ ｌ ｎ ｉ ａｅ ｔ ｈ ｏ ｅｇ ｎ ｓａ ｃ ｕ ｔ ｄ ｆ ｒａ ｏ ｔ５ ％ ｆｔ ａ ｍｂ ｒ ｅ ｅ ， ｉ ａ ｏ ｔ１ ６ ｕ ｓ ｈ ｔ ｈ ｏ ｎ ｏ ｅ ｓｒ ｉ —ｐ ｃ ｆ ｅ ｅ ｘ ｓｅ ｎ ｔ ｅ ｅ ｃ ｔａｎ ｔ ｓ ｄ ｈ ａａ ｓ ｇ ｅ ｔ ｈ ｔｔ ｅ Ｅ ｏ ｉｐ ｎ ｇ ｎ ｍｅ ｉ ａ ｔ ｎ ｎ ｑ ｅ ｔａｎ ｓ ｅ ｉ ｃ ｇ ｎ ｓ ｅ ｉｔ ｄ ｉ ｈ ａ ｈ ｓ ｉ ｅ ｔ ．Ｔ ｅ ｄ ｔ ｕ ｇ ｓｓｔ ａ ｈ ｃ ｌ ａ — ｅ ｏ ｓｖ ｓ．ａ ｄ ｕ ｉ ｕ ｉ ｒ ｅ
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202010002牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析曲星霖1，肖丹2，吴健2，马晓媛3，白翠3，王妍1*，王楠3*（1.延边大学农学院，吉林延吉133000；2.吉林省农业科学院，吉林长春130033；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春130062）摘要：为研究一株从奶牛乳样中分离到的乳腺致病性大肠杆菌（MPEC ）JL05的进化分群情况、耐药表型和耐药基因之间的相关性、毒力因子分布情况，本研究采用PCR 法、微量肉汤稀释法和高通量测序法对其进化分群、16种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC ）、毒力基因、耐药基因的检测和分析。
PCR 检测结果表明，MPEC JL05属于B2群。
MIC 检测结果表明，MPEC JL05除对磺胺异恶唑中介、对呋喃妥因敏感外，对β-内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷、抗叶酸、喹诺酮、大环内酯、四环素、苯丙醇类等8类14种抗菌药物均耐药。
全基因测序结果表明，MPEC JL05编码基因中存在MPEC 特有的fec 基因座；VFDB 数据库分析表明MPEC JL05具有黏附、侵袭、转运、铁摄取、分泌系统、细菌毒素6类80个毒力基因，并发现了耶尔森菌强毒力岛（HPI ）；CARD 数据库分析表明MPEC JL05菌株具有参与抗生素外排、抗生素失活、抗生素靶点改变、降低对抗生素的渗透性等4类耐药机制的53个耐药基因，且在质粒的耐药基因上下游发现了多个转座酶及整合酶基因。
本研究揭示了MPEC JL05复杂的进化史，为更全面的认识MPEC 基因组特征、致病力及耐药传播机制提供了参考。
关键词：大肠杆菌；进化分群；全基因组测序；耐药基因；毒力基因中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1220-06Whole genome sequencing reveals the distribution of resistance and virulence genes of mammary pathogenicEscherichia coli JL05from bovineQU Xing-lin 1,XIAO Dan 2,WU Jian 2,MA Xiao-yuan 3,BAI Cui 3,WANG Yan 1*,WANG Nan 3*(1.Agricultural College of Yanbian University,Yanij 133000,China;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China;3.Animal Disease Control Center of Jilin Provincal,Changchun 130062,China)Abstract :The aim of this study was to analyze the phylogenetic groups,virulence factor distribution,and the correlation between drug resistance phenotype and resistance genes of Escherichia coli JL05isolated from milk samples of dairy cows.The PCR,microdilution method and high-throughput sequencing were used to investigate the phylogenetic groups,MIC of 16antibacterial drugs,virulence genes and resistance genes.PCR results showed that E.coli JL05belonged to group B2.MIC results showed that E.coli JL05was sensitive to sulfamethoxazole and nitrofurantoin,but resistant to 14of Class 8antibacterial drugs,including β-lactam,cephalosporin,aminoglycoside,folic acid,quinolone,macrolide,tetracycline and phenylpropanol.The results收稿日期：2020-10-11基金项目：吉林省科技发展计划项目（20180623033TC ）作者简介：曲星霖（1997-），男，吉林长春人，硕士研究生，主要从事分子遗传研究.*通信作者：E-mail ：*****************；***************Corresponding author曲星霖，等.牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析第12期乳腺致病性大肠杆菌（Mammary pathogenic E.coli，MPEC）是奶牛乳房内感染（Intramammary infection，IMI）的主要病原体，因存在fec基因座可使细菌从柠檬酸盐中捕获铁而具有在牛乳腺中定植的能力[1]，其导致的急性乳腺炎不仅影响奶牛产奶量，同时也影响牛奶品质，增加了治疗费用，给奶牛业造成了严重的经济损失[2]。
比较基因组学鉴定大肠杆菌致病因子的教学分析
比较基因组学鉴定大肠杆菌致病因子的教学分析比较基因组学是一门研究不同物种之间基因组差异的学科，通过比较基因组分析，可以深入了解不同物种在遗传层面的差异，从而揭示各种生物的遗传特性和进化规律。
在微生物领域，比较基因组学被广泛应用于致病菌的研究，通过对比病原微生物与非致病微生物的基因组差异，可以揭示其致病机制和病原性因子，有助于深入了解病原微生物的致病机理，为防控和治疗提供重要的科学依据。
本教学分析将以大肠杆菌为例，介绍如何利用比较基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子。
一、大肠杆菌简介大肠杆菌（Escherichia coli），是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科，是人和动物肠道中的常见菌群之一。
大肠杆菌广泛存在于自然界中，既是人体的共生菌，又是一种重要的病原微生物。
其中某些菌株具有致病性，能够引起人畜的肠道感染，甚至引发严重的肠道疾病，如腹泻、肠炎等。
对大肠杆菌的致病性进行深入研究，对于预防和控制相关疾病具有重要意义。
二、大肠杆菌的致病因子大肠杆菌的致病性主要由其特有的毒力因子和致病因子所决定，其中的毒力因子主要包括毒素、细菌毛和附着因子等。
毒素是大肠杆菌最主要的毒力因子，包括肠毒素、血清素、肠毒素和淀粉酶等，它们能够对宿主细胞产生毒性作用，引起细胞损伤和炎症反应。
细菌毛是大肠杆菌附着和入侵宿主细胞的重要结构，它能够使细菌更容易附着于宿主细胞表面，引发感染。
附着因子是大肠杆菌在宿主肠道黏膜上附着和定植的重要因子，通过附着因子，大肠杆菌能够有效地抵抗肠道黏膜的清洁作用，长时间存在于肠道内，引发感染和疾病。
三、基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子利用比较基因组学分析，可以揭示大肠杆菌致病因子的基因组遗传特征，为深入研究其致病机制提供重要的科学依据。
比较基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子主要包括以下几个步骤：1. 基因组序列比对：利用测序技术对不同菌株的基因组进行测序并获得其基因序列信息；然后，将所获得的基因组序列进行比对分析，从而找出菌株间的差异和共同点。
大肠杆菌中的基因组结构和功能研究
大肠杆菌中的基因组结构和功能研究大肠杆菌是一种广泛存在于环境中和人体肠道内的细菌。
它的基因组结构和功能一直是分子生物学和微生物学研究的热门领域。
随着基因测序技术的发展，我们对大肠杆菌的基因组结构和功能的认识也越来越深入。
基因组结构大肠杆菌的基因组属于革兰氏阴性菌，它是一个圆形的DNA分子，大约有4.6兆碱基对。
它的基因组包含了大约4500个基因，其中有许多基因是与宿主细胞的生长和代谢相关的。
大肠杆菌的基因组还具有多个质粒，这些质粒通常含有一些与环境适应和抗药性相关的基因。
大肠杆菌的基因组中还有许多重复序列和转移元件。
这些序列包括了IS元件、转座子、整合子等等。
它们都能够影响基因表达和基因组稳定性，并在细菌进化中具有重要的作用。
功能研究大肠杆菌中的基因组结构和功能研究主要包括以下几个方面。
基因功能注释随着大肠杆菌基因组测序的完成，相应的基因功能注释也日益完善。
目前已有大量的基因在数据库中被标注了功能和注释信息，这对于后续的基因调控、表达和功能研究提供了重要的数据支持。
转录调控在大肠杆菌中，转录调控是一种重要的基因调控机制。
研究者发现大肠杆菌基因组中存在大约350个调控因子。
这些调控因子通常能够识别特定的DNA序列，在特定条件下调控相应基因的表达。
研究发现，其中的一些调控因子还具有重要的作用，如lac重pressor、trp重pressor等。
新基因鉴定随着转录组和蛋白质组学技术的发展，大肠杆菌中的新基因鉴定越来越重要。
许多研究者利用这些技术，鉴定出了大量的新基因，其中包括了一些与代谢途径、抗药性和环境适应有关的基因。
基因组稳定性在细菌进化中，基因组稳定性是非常重要的。
大肠杆菌中的基因组稳定性与它的保护性随机DNA修复系统、R-质粒的结构和核苷酸代谢等多个方面有关。
研究人员对这些方面进行了深入探究，为我们对细菌基因组稳定性的了解提供了一定程度的帮助。
结论大肠杆菌是一个重要的微生物模型生物，它的基因组结构和功能一直是分子生物学和微生物学研究的热门领域。
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法主要有以下几种：
1. 整体基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）：将
细菌的整个基因组进行测序，并通过比对参考基因组或组装建立一个完整的基因组序列。
2. 目标区域测序（Targeted Sequencing，TS）：针对特定基因、基因组区域或有意义的变异位点进行测序。
3. 细胞单体测序（Single-cell Sequencing，SCS）：将细胞单
体进行测序，通过技术手段将单个细胞的DNA扩增到足够浓
度后进行测序。
4. 转录组测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）：将细菌转录产物测序，包括mRNA、ncRNA等，可以了解细菌的转录水平
和转录后调控。
5. 甲基化测序（Methylation Sequencing，Methyl-Seq）：对细
菌基因组进行甲基化修饰位点的检测以获得表观遗传信息。
6. 大肠杆菌的测序方法还包括平滑野百合花青素基因组测序（PacBio）和人工合成DNA 和4D核磁共振测序。
第五章基因组测序技术(共118张PPT)
断裂产物分 别在4个泳 道电泳
G G+A T+C C
化学法测序实例
哌啶
改进的特异化学切割反应
1.基本原理
与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延 伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异 性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶 活性。
制备单链模板
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行
序列组装，排成重叠克隆群.
基于克隆群(contig-based)
鸟枪法策略
指导测序策略
遗传、物理图谱
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序.
如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很 容易从 cDNA中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其
2. 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 上值得纪念的一天。人 类基因组的工作草图已 经绘制完毕并于这天向 全世界公布。最终完成 图要求测序所用的克隆 能忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列错 误率低于万分之一。
大肠杆菌中的基因表达
PL 和 PR 表达系统
宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL
或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP
CAP lacI
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（3）表达产物的稳定性： 组建融合蛋白； 利用信号肽； 特异性突变； 位点特异突变，改变二硫键位置； 宿主蛋白酶缺陷。
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（4）细胞的代谢负荷： 细胞大量生长时，抑制外源基因的表达； 宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开；
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和ATG的间距等。
A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加
基因的表达。lac、trp、 tac、bla。
B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码
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循环阵列测序—焦磷酸测序
循环阵列测序—碱基读取
Hale Waihona Puke 几种不同生物基因组的测序1) 大肠杆菌基因组测序----图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 3) 果蝇基因组测序---鸟枪法 4) 人类基因组测序---图位法和鸟枪法 4) 拟南芥基因组测序—图位法 5) 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法
流感嗜血杆菌基因组鸟枪法测序结果预测
1) 流感嗜血杆菌基因组总长: 1.8 Mb 2) 测序覆盖率计算, P定义为丢失的概率.
P0=e-m, m为覆盖面, 即当量数 若m=1 P0=e-1=0.37 若m=5 P0=e-5=0.0067=0.67% 若m=10 P0=e-10=4.5 x 10-5=0.000045=0.0045%
high signal density, geometric uniformity, strong feature separation, and a size that is small but still resolvable by inexpensive optics.
循环 阵列 测序
富集
与 测序 芯片 制作
基因组测序的策略
1) 随机测序 2) 限定序
随机测序原理
基因组测序的方法
1) 测序的DNA多聚酶; 2) 测序标记; 3) 电泳装置; 4) 测序难点.
测序的DNA多聚酶
目前普遍采用的测序酶为Sequenase, 来自T7噬菌体
序数)=100 bp. 7) 空隙数为:1.25 x 104bp/100 bp=128
测序结果略高于预计结果, 即42个物理间隙和98个顺序间隙.
间隙的类型
测序后将DNA顺序进行组装, 会发现存在不 连续的区段. 它们产生于: 1) 因覆盖率的原因而留下克隆载体自身的限制或DNA顺序特殊 的组成等原因造成某些顺序丢失或未能 克隆, 这类间隙称为物理间隙.
ATP 产 生荧光信号与dNTP 和ATP 的降解等化
学
循环阵列测序--滚环扩增建库 cyclic-array sequencing
测
滚环复制
序
拷贝扩增
文
库
构
建
循环阵列测序-PCR建库
Polymerase colony, or polony,technologies perform multiplex amplification while maintaining spatial clustering of identical amplicons. In emulsion PCR (ePCR), a waterin-oil emulsion permits millions of noninteracting amplifications within a milliliter-scale volume . Amplification products of individual compartments are captured via inclusion of 1-mm paramagnetic beads bearing one of the PCR primers . Any single bead bears thousands of single-stranded copies of the same PCR product, whereas different beads bear the products of different compartmentalized PCR reactions . The beads generated by ePCR have highly desirable characteristics:
3) 两端测序, 每次有效的可读顺序为460 bp, 每个克隆为920 bp. 4) 随机挑选质粒载体克隆9600个, λ载体克隆500个. 两端测序
共获得测序总长为8.84 x 106, 覆盖面约5, P0=e-5=0.67%. 5) 预计丢失的顺序为L x e-m=1.8 Mb x 0.0067=1.25 x 104 bp. 6) 空隙长度为: L/n=1.8 Mb /(9600 x 2) (L为基因组总长, n为测
顺序间隙缝合
物 理 间 隙 缝 合
流感嗜血杆菌基因组测序结果
1) 两端测序的结果称为读序(read), 每个读序 长约400 bp.
2) 在DNA顺序组装前,由自动测序仪给出的每个读 序都必须经PhredII软件处理, 以确定给出的 顺序质量与可靠性.这一步为顺序认可 (calling for).
Sanger测序法: 同位素标记电泳测序
荧光标记电泳测序
毛 细 管 电 泳 测 序
毛 细 管
第一代 和
第二代 DNA测序
中断测序 连续测序
焦磷酸测序技术
pyrosequencing
焦磷酸测序技术是一 种新的实时DNA 测
序 技术。它在DNA 聚
合 酶、三磷酸腺苷硫酸 化酶、荧光素酶和三 磷酸腺苷双磷酸酶 4 种酶的协同作用 下，使引物延伸聚合 脱氧核糖核酸. dNTP 释放焦磷酸盐PPi、 PPi转换为三磷酸腺 苷（ATP）、
注: 线虫为单性(X或Y)或雌雄同体(XX), Y染色体未测序.
流感 嗜血 杆菌 基因 组鸟 枪法 测序 时的变异率. 此外, 2 kb大小 降低了克隆片段含有完整基因的可能性,有 些完整基因的表达产物对宿主菌是有克隆测序均为两端 测序.
大肠杆菌基因组测序（1）
大肠杆菌基因组（C区）测序
大肠杆菌C区测序采取了分割染色体DNA 的技术, 将切离的一段染色体DNA与人工插 入的复制载体整合, 获得可独立扩增的克隆 片段用于鸟枪法测序.
LoxP
Cre
重 组 系 统
大肠杆菌基因组C区测序步骤(1)
大肠杆菌基因组C区测序步骤(2)
线虫基因组测序策略---图位法