微生物数量测定汇总

《环境微生物新技术》课程作业

2.微生物数量测定方法有哪些？空气、水、土壤样品分别适用哪些方法？请举例说明。

常见微生物数量的测定方法

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1.计数器测定法：

即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。2、电子计数器计数法:

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3、活细胞计数法 :

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。

此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。

广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4、比浊法

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

5、测定细胞重量法

此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。

6、测定细胞总氮量或总碳量

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）

通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例单介绍其操作：

（1）取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。

（2）在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管（3）于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.

取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数或做片在显微镜下数，均称为显微镜直接计数法。

用琼脂平板计数，称为菌落计数法。

一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。

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微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大类，由于多数微生物的个体较小，肉眼无法观察，对其计数一般比较困难。在目前的微生物实验教学,对微生物计数的方法主要有三大类：总细胞计数法、活细胞计数法和微生物生长量测定法。并不是每一种方法都是通用的,不同的微生物种类需要不同的计数方法, 目前多用以下8种方法进行计数：

1.总细胞计数法

1.1 血细胞计数板计数法血细胞计数板是一块特制的载玻片,其上划有计数室,通过对计数室中的微生物数量的读取,计算原溶液中的微生物数量。此方法由于计数板较厚,且计数室的高度是0.1mm ,不能采用油镜进行观察,故只能对体积较大的真核微生物进行测定,如酵母菌、霉菌抱子等,只能测得所有细胞的总数,不能区别死细胞和活细胞,尤其是对运动能力强的活细胞难以计数。

目前已经提出一些方法,如结合特定的美蓝染色技术,区别酵母菌死活细胞,将运动的细胞加人甲醛溶液中,破坏其运动以便计数等。1.2 细菌计数板计数法细菌计数板是在血细胞计数板的基础上改进而来,主要是降低计数板的厚度,同时将计数室的高度从0.1mm 降低到0.02mm ,以用油镜对较小的原核微生物进行计数。

1.3 膜过滤计数法利用计数板对高浓度的菌液测定比较准确,但当样品中细菌的数量很低时,如湖水、海水或饮用水等,用膜过滤计数法更精确些,可以将一定体积样品溶液加结晶紫染色,再用

0.02um的聚偏二氟乙烯膜负压过滤,再用无菌水冲洗至无色后,将过滤的膜进行抽干,将膜放到载玻片上,滴加甘油,盖上盖玻片,即可在显微镜下计数。一般随机抽取20个视野进行计数,最后算平均数,计算整个滤膜上的菌的数量,得到原菌液中的微生物数量。

此测定方法一般只能用于样品中细菌数量很低的情况,多数时候细菌个体由于粘附成团而影响结果。所以,过滤前的细胞分散处理很重要,例如将细菌悬液经过酸碱或超声波处理,将聚团的细胞打散, 可以增加此方法的准确性。

2.活细胞计数法

2.1 平板菌落计数法平板菌落计数法只能用于测定活细胞的数量,但是操作过程相对计数板而言复杂一些,而且测得的细菌数量往往小于实际值。主要原因是在计算细菌浓度时,往往每个菌落并不一定是由一个单细胞生长繁殖而来,有可能是2个或多个,致使结果比实际菌液样品中的细菌数量低,这也就是为什么现在都用菌落形成单位数（cfu/mL）来取代过去的绝对细菌数量。为了使菌落数更接近实际菌液中细菌的数量值, 目前多数办法是:尽量扩大稀释倍数,涂布平板时少取稀释菌液,使平板中的菌落数减少,避免由于菌液中细菌数过多造成多个细菌形成一个菌落。例如,将系列梯度稀释至10-8或更低(稀释倍数取决于原菌液)。

2.2 比浊法微生物细胞在一定浓度范围内,与浊度成正比,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大。故可通过分光光度计测定吸光值,通常测定600nm下的吸光值OD600 ,通过与标准曲线对比,求出样品