第4章 微生物的生长

第4章微生物的生长本章的学习目的与要求⑴掌握微生物生长的概念，个体生长与群体生长的关系。

⑵掌握衡量微生物群体生长的指标，微生物生长量的测定方法。

⑶了解微生物的群体生长规律和环境因素对微生物生长的影响。

1. 微生物生长1.1微生物生长的概念一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。

如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。

如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。

随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、体积、密度或浓度作指标来衡量。

所以：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖这里需要强调的是，上述微生物生长的阶段性，对于单细胞微生物来说是不明显的，往往在个体生长的同时，伴随着个体的繁殖，这一特点，在细菌快速生长阶段尤为突出，有时在一个细胞中出现2或4个细胞核；除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义，因此，在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。

这一点与研究高等生物时有所不同。

微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标；同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、霉腐微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关。

下面对微生物的生长繁殖及其控制的规律作较详细的介绍。

1.2微生物生长量的测定既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。

1.2.1 稀释平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。

取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。

在最适条件下培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。

在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50～500个菌落为宜。

这种方法在操作时，有较高的技术要求。

其中最重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。

有人认为，对原菌液浓度为109个/mL的微生物来说，如果第一次稀释即采用10-4级（用10μL菌液至100mL无菌水中），第二次采用10-2级（吸1mL上述稀释液至100mL无菌水中），然后再吸此菌液0.2mL进行表面涂布和菌落计数，则所得的结果最为精确。

其主要原因是，一般的吸管壁常因存在油脂而影响计数的精确度（有时误差竟高达15％）。

这一稀释过程的示意图详见实验技术。

1.2.2 血球计数板法是用来测定一定容积中的细胞总数目的常规方法（详见第十章实验五）。

这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外测定结果是微生物个体的总数，其中包括死亡的个体和存活的个体，要想测定活菌的个数，还必须借助其它方法配合。

1.2.3 称干重可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%～20%。

在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤1～5次后，进行干燥。

干燥温度可采用105℃、100℃或红外线烘干，也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。

以细菌为例，一个细胞一般重约10-12～10-13g。

另一种方法为过滤法。

丝状真菌可用滤纸过滤，而细菌则可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。

过滤后，细胞可用少量水洗涤，然后在40℃下真空干燥，称干重。

以大肠杆菌为例，在液体培养物中，细胞的浓度可达2×108个/mL。

100mL培养物可得10～90mg干重的细胞。

这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。

1.2.4 比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。

最古老的比浊法是采用MoFarland比浊管。

这是用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。

某一未知浓度的菌液只要在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者透光度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。

如果要作精确测定，则可用分光光度计进行。

在可见光的450～650nm波段内均可测定。

为了对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪，可采用不必取样的侧壁三角烧瓶来进行。

测定时，只要把瓶内的培养液倒入侧臂管中，然后将此管插入特制的光电比色计比色座孔中，即可随时测出生长情况，而不必取用菌液（图5-1）。

图5-1 测定生长用的侧臂三角烧瓶1. 侧臂试管三角烧瓶；2. 侧臂试管；3. 侧臂试管插座；4. 比色架面板；5. 连接螺丝；6. 比浊测定透光窗；7. 光路开关孔；8. 比色架底板以上介绍了若干测定微生物的生长量或计算繁殖数的主要方法。

其中，最常用的为称干重、测浊度（用分光光度计）用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。

必须指出的是，不管用什么方法，都有其优缺点和使用范围。

所以，在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。

1.3 微生物的群体生长规律单细胞的微生物，如细菌、酵母菌在液体培养基中，可以均匀地分布，每个细胞接触的环境条件相同，都有充分的营养物质，故每个细胞都迅速地生长繁殖。

霉菌多数是多细胞微生物，菌体呈丝状，在液体培养基中生长繁殖的情况与单细胞微生物不一样，如果采取摇床培养，则霉菌在液体培养中的生长繁殖情况，近似于单细胞微生物。

因液体被搅动，菌丝处于分布比较均匀的状态，而且菌丝在生长繁殖过程中不会象在固体培养基上那样有分化现象，孢子产生也较少。

1.3.1典型的生长曲线微生物生长繁殖的速度非常快，一般细菌在适宜的条件下，大约20~30分钟就可以分裂一次，如果不断迅速地分裂，短时间内可达惊人的数目，但实际上是不可能的。

在培养条件保持稳定的状况下，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，发现在培养的开始阶段，菌体数目并不增加，一定时间后，菌体数目就增长很快，继而菌体数目增长速度保持稳定，最后增长速度逐渐下降以致等于零。

如果以培养时间为横坐标，以以活菌数的对数值作纵坐标，就可作出一条生长曲线。

这生长曲线（growth curve）代表单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。

根据微生物的生长速率常数（growth rate constant），即每小时的分裂代数的不同，一般把典型的生长曲线粗分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。

见图4-1：⑴延滞期（lag phase）又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。

延滞期有如下特点：1）生长的速率常数为零。

2）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂作准备。

3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和的合成加快，易产生诱导酶。

4）对不良环境敏感，例如pH、Nacl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。

延滞期出现的原因，可能是为了重新调整代谢。

当细胞接种到新的环境（如从固体培养基接种到液体培养基）后，需要重新合成必需的酶类、辅酶或某些中间代谢产物，以适应新的环境而出现生长的延滞期。

为了提高生产效率，发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，具有十分重要的意义，其方法主要有：1）以对数期的菌体作种子菌，因对数期的菌体生长代谢旺盛，繁殖力强，抗不良环境和噬菌体的能力强，采用对数期的菌体作种子，延滞期就短。

2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个重要因素，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。

一般采用3%~8%的接种量，根据生产上的具体情况而定，最高不超过1/10。

3）培养基的成分为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基，通常微生物生长在营养丰富的天然培养基中比营养单调的组合培养基中快。

⑵对数期（logarithmic phase）又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。

此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generation time）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。

在对数期中，以下三个参数尤为重要。

1) 繁殖代数（n）由图4-2可以得出：x2 = x1 · 2n以对数表示：lgx2 =lgx1＋nlg2∴ n= = 3.322(lgx2－lgx1)2) 生长速率常数（R）如前所述生长速率常数的定义的可知：R = =3) 代时（G）如前所述平均代时的定义可知：G = =影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有：菌种：不同微生物代时差别大，即使是同一菌种，由于培养基成分和物理条件（如培养温度、培养基的pH和营养物质的性质）的不同，其对数期的代时也不同。

但是，在一定条件下，各种菌的代时是相对稳定的，多数为20~30分钟，有的长达33小时，快的只有9.8分钟左右。

如表4-1。

表4-1 不同细菌的代时细菌培养基温度（℃）代时（分）漂浮假单胞菌（Pseudomonas natriegenes）肉汤 27 37 9. 8大肠杆菌（Escherichia coli）肉汤 37 17蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）肉汤 30 18嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）肉汤 55 18.3枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）肉汤 25 26 –32巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）肉汤 30 31乳酸链球菌（Streptococcus lactis）牛乳 37 26嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）牛乳 37 66 –87伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）肉汤 37 23 .5金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）肉汤 37 27 –30霍乱弧菌（Vibrio cholerae）肉汤 37 21 –38丁酸梭菌（Clostridium butyricum）玉米醪 30 51大豆根瘤菌（Rhizobium japonicum）葡萄糖 25 344 – 461结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）合成 37 792 –932活跃硝化杆菌（Nitrobacter agilis）合成 27 1200梅毒密螺旋体（Treponema pallidum）家兔 37 1980褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）葡萄糖 25 240营养成分：同种细菌，营养丰富的培养基，其代时就短，反之则长。