第六章微生物的生长与控制
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第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
微生物的生长繁殖及其控制
每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5
注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌
C，比浊法 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度 (optical density, 即O.D.)表示菌量。 注意： 测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准
2.重量法 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 以干重（105℃）、湿重直接衡量微生物群体
P146
1.个体计数法 A.直接法
利用血球 计数板， 在显微镜 下计算一 定容积里 样品中微 生物的数 量。
缺点：
不适于1对m运m动2 细菌2的5（计1数6）；中格 需要相对高1的6（细2菌5浓）度小；格， 个体小的细共菌4在00显小微格镜下难以观察；
B.简接法
原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可 以通过生长形成菌落。
• 高密度培养常用于重组蛋白质药物的生产; • 主要的优势:节约成本.
六、微生物培养法概论
• 实验室培养法; • 生产实践中微生物培养法;
实验室培养法
固体培养法
好氧菌：斜面、琼脂平板等
厌氧菌：高层琼脂柱、、厌氧 培养皿、厌氧罐等
液体培养法
试管液体培养 三角瓶液体培养 摇瓶培养 台式发酵罐
生产实践中微生物培养法
μ ：比生长速率，每单位数量细菌
在单位时间增加的量 t：培养时间
重要参数:
（1）繁殖代数（n）
x2=x1·2n 以对数表示： lgx2=lgx1+nlg2
n= 3.322 (lgx2-lgx1)
（2）比生长速率常数（μ）
lgNt - lgN0) μ=
t - t0
（3）代时（G）:在群体生长里,细菌数量增加一
注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌
C，比浊法 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度 (optical density, 即O.D.)表示菌量。 注意： 测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准
2.重量法 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 以干重（105℃）、湿重直接衡量微生物群体
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1.个体计数法 A.直接法
利用血球 计数板， 在显微镜 下计算一 定容积里 样品中微 生物的数 量。
缺点：
不适于1对m运m动2 细菌2的5（计1数6）；中格 需要相对高1的6（细2菌5浓）度小；格， 个体小的细共菌4在00显小微格镜下难以观察；
B.简接法
原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可 以通过生长形成菌落。
• 高密度培养常用于重组蛋白质药物的生产; • 主要的优势:节约成本.
六、微生物培养法概论
• 实验室培养法; • 生产实践中微生物培养法;
实验室培养法
固体培养法
好氧菌：斜面、琼脂平板等
厌氧菌：高层琼脂柱、、厌氧 培养皿、厌氧罐等
液体培养法
试管液体培养 三角瓶液体培养 摇瓶培养 台式发酵罐
生产实践中微生物培养法
μ ：比生长速率，每单位数量细菌
在单位时间增加的量 t：培养时间
重要参数:
（1）繁殖代数（n）
x2=x1·2n 以对数表示： lgx2=lgx1+nlg2
n= 3.322 (lgx2-lgx1)
（2）比生长速率常数（μ）
lgNt - lgN0) μ=
t - t0
（3）代时（G）:在群体生长里,细菌数量增加一
第六章 微生物的生长及其控制1
获得同步生长的方法： 获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化化化化 物物化化
过过过 区区区区区区区区过 膜膜膜过
获得同步生长的方法主要有两类： 获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细 胞周期不同的周期变化。 胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 不影响细胞代谢。 不影响细胞代谢。
☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律， 论也基本适用于酵母菌。 论也基本适用于酵母菌。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 死亡的整个动态变化过程。 死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却 每种细菌都有各自的典型生长曲线， 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。
二、以数量变化对微生物生长情况进行测定 （一）直接法
将待测样品制成菌悬液，适当稀释， 将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方 格网的计数室内，在显微镜下直接计数； 格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的 体积一定， 体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个 数； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 要点：菌悬液浓度应在 个细胞/毫升左右 毫升左右； 要点：菌悬液浓度应在108个细胞 毫升左右；
第六章微生物的生长及其控制
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
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一些细菌的代时
菌名
培养基 培养温度 代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃ 17min
E. coli
牛奶
37
12.5
Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）
肉汤或牛奶 37
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
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（1）恒浊器 — 恒浊连续培养
Ø特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长 ，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺 复杂，烦琐。 Ø使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相 平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
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（二）指数期
1、特点： Ø 生长速率常数R最大，即代时最短; Ø细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致; Ø酶系活跃，代谢最旺盛。
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x2
2、指数期中的的
三个重要参数
x1
t1
t2
u繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
u生长速率常数R= u代时G=
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（三）稳定期
1、特点： （1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 （2）菌体产量达到了最高点。 （3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。 （4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢； （5）通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。
第六章微生物的生长及其控制
（2） 恒化器：
与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液 流速保持不变，并使微生物始终在低于最高 生长速率下进行生长繁殖的一种连贯培养装 置 在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增 长而增高，另一方面，限制因子的浓度会随 时间的增长而降低，（使菌体生长慢），两 者相互作用，会出现生长与流速相平衡，这 样，即可获得一定生长速率的均一菌体，又 可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定 菌体密度的菌体。
3、 防腐：（Antisepsis）
是指利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁 殖，从而达到防止食品等发生霉变的措施。
措施：
（1） 低温： （2） 缺氧： （3） 干燥： （4） 高渗： （5） 高酸度： （6） 防腐剂：
4、化疗：（Chemotheraph）
即化学治疗，它是利用对病原菌具有高度毒力，而对 宿主细胞无显著毒性的化学物质来抑制宿主体内病原 微生物的生长繁殖，借以达到治疗在目的。
连续培养的优缺点：
优点： A、高效，简化了装料、灭菌，出料、清洗等 程序。 B、产品质量较稳定。 C、自控，可利用各种仪表加以控制。 D、节约人力、动力、资源（水、汽等） 缺点： A、菌种易于退化 B、易遭杂菌污染。
第二节 影响微生物生长的主要因素
影响微生物生长的外界因素很多，除一些营养 条件外，还有许多物理条件，其中最重要的有 温度，PH、氧气等。 一、 温度： 微生物的生长T有宽窄，但总有最低生长T，最 适生长T，最高T。并称为生长温度三基点。 最低生长T：一般-5---10。C，极端为-30。C 最适生长T：嗜冷菌；中温菌；嗜热菌。 最高生长T：一般为80—95。C，极端为105— 300。C。
三、 影响加压灭菌效果的因素：
微生物的生长及其控制填空题1一条典型的生长曲线至少
第六章微生物的生长及其控制一、填空题1、一条典型的生长曲线至少可分为、、、四个生长时期。
2、根据微生物对氧气的需要可把微生物分为、、、、五种类型。
3、细菌生长的最适pH范围为，酵母菌生长的最适pH值范围为，霉菌生长的最适pH范围为，好气微生物生长的最适Eh值为。
4、中温微生物生长的最适温度为高温微生物生长的最适温度为，低温微生物生长的最适温度为。
5、巴氏消毒工艺条件为，实验室常用培养基灭菌工艺条件为，常压蒸汽灭菌工艺条件为。
6、加热是消毒灭菌中用得最广泛的方法，加热灭菌可分为__________和____________。
紫外线主要用于物体表面和空气消毒，这是由于它的______________________能力差。
7、影响微生物生长延滞期的因素有________、________、________、_________。
8、影响微生物耐热力的因素有__________、__________、__________、_________、。
9、影响微生物生长的物理因素除温度外，还有___________、____________、、等。
10、用血球计数板进行细菌计数所得细菌数中包含了_____________和____________两部分。
11、细菌总数测定方法可分为_________、__________、。
12、获得细菌同步生长的方法主要有（1）和（2），其中（1）中常用的有、和。
13、抗生素的作用机制有、、和。
二、选择题1、某细菌悬液经100倍稀释后，在血球计数板上，计得平均每小格含菌数为7.5个，则每毫升原菌悬液的含菌数为( )A、3.75×107个B、2.35×107个C、3.0×109个D、3.2×109个2、可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基为( )A、完全培养基B、基本培养基C、补充培养基D、鉴别培养基3、直接显微镜计数用来测定下列所有微生物群体的数目，除了( )之外。
第六章 微生物生长
恒化连续培养
随着细菌的生长，限制性因子的浓
度降低，致使细菌生长速率受限，但同 时通过自动控制系统来保持限制因子的 恒定流速，不断予以补充，就能使细菌 保持恒定的生长速率。 常见的限制性营养物质有作为氮源 的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、乳 酸及生长因子，无机盐等。
三、同步培养
微生物细胞极其微小，但它也有一个自小到大 的过程，即个体生长。要研究微生物的个体生 长，在技术上是极为困难的。 目前主要使用的方法是： 同步培养技术分析细胞各阶段的生物化学特性 变化。 电子显微镜观察细胞的超薄切片。
死亡原因？ 营养短缺；代谢毒物增 多；pH、Eh改变；溶氧 不足。
t
时间
稳定期与生产实践
指导思想：延长稳定期。 措施： 1.调节pH； 2.注意降温、通风； 3.中和排除有毒代谢产物； 4.稳定期是生产收获时期，注意把握好收获时机。
（4）衰亡期（老年）
死亡率＞出生率 ？ 细胞畸形 细胞死亡,出现自溶 有的微生物细胞产生或释放出一些产物。 如氨基酸、转化酶、抗生素等。现象。
单细胞微生物典型生长曲线
生 长 速 + 率 0 指 数 期
延滞期 指数期 稳定期 衰亡期
_
菌 数 目 的 对 数 值
延 滞 期
总菌数
稳定期
衰 亡 期
活菌数
0 时间t
微生物的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时 方便，0-10代表1～1010
（1）延滞期－“万事开头难”
特征： 代谢活跃，个体体积、重量增加，
（2）指数期（青年）
快，平均代时（繁殖一代的时间）最短， 生长速率常数最大。 细胞的化学组成、形态、生理特性比较一致。
06第六章 微生物的生长及控制
1. 微生物生长繁殖的pH值
大多数细菌、放线菌喜欢生活在中性偏碱的环境中， 细菌最适的pH在7.0~8.0之间，放线菌的最适pH在7.5~8.5 之间； 而酵母菌和霉菌刚好相反，适合在偏酸的条件下生 长，霉菌的最适pH值在4.0~5.8之间，酵母菌在3.8~6.0之 间。
2. pH值对微生物生长的影响
稀释倒平板法
操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！
2. 膜过滤培养法
菌数低的样品（如水）→ 膜过滤 → 培养 → 菌落计数
3. 显微镜直接计数法
缺点：
① 不能区分死菌与活菌 ② 不适于对运动细菌的计数 ③ 需要相对高的细菌浓度 ④ 个体小的细菌在显微镜下难以观察
4. 比浊法
5. 重量法
为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？
氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧 离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过 氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过 程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化 物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由 基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧 气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能 合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。
将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净， 然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其 干重。一般来说，干重约为湿重的10~20%，即 1mg干菌 = 5~10mg湿菌 = 4~5×109个菌体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6.氮量法(生理指标法)
微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以 常作为生长量的指标。如细菌含氮量约为菌体 干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白 质含量。
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2．体积测量法 体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积 培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。 具体方法是取一定量的待测培养液（如10mL）放 在有刻度的离心管中（如图6-5），设定一定的离 心时间（如5min）和转速（如5000rpm），离 心后，倒出上清液，测出上清液体积为V，则菌丝 浓度为（10-V）/10。菌丝浓度测定法是大规模 工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测 指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设 定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀 物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
1．机械法 这是一类根据微生物细胞在 不同生长阶段的细胞体积和质 量不同或根据它们同某种材料 结合不同的原理设计出来的方 法。其中常用的有以下几种方 法。
同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细 胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。
以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶 段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。
同步培养细胞常被用来研究在单个细胞上难以研 究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它 是一种理想的材料。
同步培养方法很多，可归纳为 机械法与环境条件控制法两类。
产CO2（用标记葡萄糖做基质）、耗氧、黏度、产热等指标，都可用于生 长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物 活性等方面的测定反映微生物的生长。
（4）商业化快速微生物检测法 微生物检测的发展方向是快速、准 确、简便、自动化，当前很多生物 制品公司利用传统微生物检测原理， 结合不同的检测方法，设计了形式 各异的微生物检测仪器设备，这些 仪器设备正逐步应用于医学微生物 检测和科学研究领域。例如全自动 微生物快速检测系统（如图6-6）可 以在数小时内获得监测结果，样本 颜色及光学特征都不影响读数，对 酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏 感。
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2．活菌计数法 活菌计数法是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其
活菌数的方法，故又称平板计数法（如图6-3）。活菌计数法的特点 是计算的结果是活菌落。在进行活菌计数时要注意样品的稀释度，保 证一个活细胞可形成一个菌落。
（1）涂布平板法 用灭菌的涂布器将一定体积（不大于0.1mL）适当稀释度的菌液涂布 在琼脂培养基的表面，然后保温培养到有菌落出现，记录菌落的数目 并换算成每毫升试样中的活细胞数量。
图6-8 霉菌菌丝生长（图中 的数字为分钟）
第二节 微生物的生长规律
研究微生物的生长规律，需要从研究微生物的个体生 长和群体生长两个方面着手。
一、微生物的个体生长和同步生长
以细菌为例介绍微生物的个体生长和同步生长。 目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。 一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片； 二是采用同步培养方法。
图6-6 全自动微生物快速检测系统
（三）菌丝长度的测定方法
对于丝状微生物，特别是丝状真 菌，通常是通过测定菌丝的长度变 化来反映它们的生长速率，主要采 用的有如下几种方法。
1．培养基表面菌体生长速率测 定法
培养基表面菌体生长速率测定法主 要测定一定时间内在琼脂培养基表 面菌落直径的增加值。一般采用载 玻片培养法，方法如图6-7。
图6-7 载玻片培养法
2．培养料中菌体生长速率测定法
主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向 前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体 生长速率的测定。
3．单个菌丝顶端生长速率测定法
具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板 的中心，生长一定时间后，将平板置于显微镜 载物台上，同时校对所用显微镜的目镜测微尺， 并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌 丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺 与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位 与目镜测微尺上的一条刻度线重合，这个点即 为“参照点”，每隔一定时间测量一次菌丝生 长的长度。
（2）倒平板法 将样品稀释到一定浓度，取一定体积（0.1mL～1mL）倒入冷却至 45℃的固体培养基中混合，然后倒入无菌平皿中制成平板，培养后出 现菌落，由菌落数推算出活菌总数。
图6-3 涂布平板法和倒平板法
（3）滤膜过滤法
当待测样品中菌数很低时，可以将样品通过膜过滤器（如图6-4），然 后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。
图6-4 滤膜过滤法
（二）微生物生理指标的测定方法
测定微生物生长的相关生理指标，也可以间接的反应出微生物的生长量， 常用以下方法来测定。 1．重量法 此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、 多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。 将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，离心后直 接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间 的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将 它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干 燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。一般说来，干重为湿重的 10%～20%。
（2）氨基氮的测定 具体方法是离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加
入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入上清液18%的中性甲醛，反 应片刻，加入0.02N的NaOH使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮 的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。
（3）其他生理物质的测定 P、DNA、RNA、ATP、NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸、产气、
图6-5 刻度离心管
3．测定菌种细胞内化学成分
测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂，操作困难，但较准确，菌种 细胞内化学成分的多少，可反映出群体中菌体数量的多少。
（1）测定含氮量
微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标，大多 数细菌的含氮量为其干重的12.5％，酵母菌为7.5％，霉菌为6.0％。 根据其含氮量再乘以6.25，即可测得其粗蛋白的含量（包括了杂环氮 和氧化型氮）。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%～80%，一般 以65%为代表，因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式 计算：