第 六 章 微生物的生长及其控制
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第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
第六章 微生物的生长及其控制1
获得同步生长的方法： 获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化化化化 物物化化
过过过 区区区区区区区区过 膜膜膜过
获得同步生长的方法主要有两类： 获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细 胞周期不同的周期变化。 胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 不影响细胞代谢。 不影响细胞代谢。
☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律， 论也基本适用于酵母菌。 论也基本适用于酵母菌。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 死亡的整个动态变化过程。 死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却 每种细菌都有各自的典型生长曲线， 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。
二、以数量变化对微生物生长情况进行测定 （一）直接法
将待测样品制成菌悬液，适当稀释， 将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方 格网的计数室内，在显微镜下直接计数； 格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的 体积一定， 体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个 数； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 要点：菌悬液浓度应在 个细胞/毫升左右 毫升左右； 要点：菌悬液浓度应在108个细胞 毫升左右；
第六章微生物的生长及其控制
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
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一些细菌的代时
菌名
培养基 培养温度 代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃ 17min
E. coli
牛奶
37
12.5
Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）
肉汤或牛奶 37
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
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（1）恒浊器 — 恒浊连续培养
Ø特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长 ，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺 复杂，烦琐。 Ø使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相 平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
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（二）指数期
1、特点： Ø 生长速率常数R最大，即代时最短; Ø细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致; Ø酶系活跃，代谢最旺盛。
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x2
2、指数期中的的
三个重要参数
x1
t1
t2
u繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
u生长速率常数R= u代时G=
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（三）稳定期
1、特点： （1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 （2）菌体产量达到了最高点。 （3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。 （4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢； （5）通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。
第六章微生物的生长及其控制
（2） 恒化器：
与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液 流速保持不变，并使微生物始终在低于最高 生长速率下进行生长繁殖的一种连贯培养装 置 在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增 长而增高，另一方面，限制因子的浓度会随 时间的增长而降低，（使菌体生长慢），两 者相互作用，会出现生长与流速相平衡，这 样，即可获得一定生长速率的均一菌体，又 可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定 菌体密度的菌体。
3、 防腐：（Antisepsis）
是指利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁 殖，从而达到防止食品等发生霉变的措施。
措施：
（1） 低温： （2） 缺氧： （3） 干燥： （4） 高渗： （5） 高酸度： （6） 防腐剂：
4、化疗：（Chemotheraph）
即化学治疗，它是利用对病原菌具有高度毒力，而对 宿主细胞无显著毒性的化学物质来抑制宿主体内病原 微生物的生长繁殖，借以达到治疗在目的。
连续培养的优缺点：
优点： A、高效，简化了装料、灭菌，出料、清洗等 程序。 B、产品质量较稳定。 C、自控，可利用各种仪表加以控制。 D、节约人力、动力、资源（水、汽等） 缺点： A、菌种易于退化 B、易遭杂菌污染。
第二节 影响微生物生长的主要因素
影响微生物生长的外界因素很多，除一些营养 条件外，还有许多物理条件，其中最重要的有 温度，PH、氧气等。 一、 温度： 微生物的生长T有宽窄，但总有最低生长T，最 适生长T，最高T。并称为生长温度三基点。 最低生长T：一般-5---10。C，极端为-30。C 最适生长T：嗜冷菌；中温菌；嗜热菌。 最高生长T：一般为80—95。C，极端为105— 300。C。
三、 影响加压灭菌效果的因素：
第六章 微生物生长
恒化连续培养
随着细菌的生长，限制性因子的浓
度降低，致使细菌生长速率受限，但同 时通过自动控制系统来保持限制因子的 恒定流速，不断予以补充，就能使细菌 保持恒定的生长速率。 常见的限制性营养物质有作为氮源 的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、乳 酸及生长因子，无机盐等。
三、同步培养
微生物细胞极其微小，但它也有一个自小到大 的过程，即个体生长。要研究微生物的个体生 长，在技术上是极为困难的。 目前主要使用的方法是： 同步培养技术分析细胞各阶段的生物化学特性 变化。 电子显微镜观察细胞的超薄切片。
死亡原因？ 营养短缺；代谢毒物增 多；pH、Eh改变；溶氧 不足。
t
时间
稳定期与生产实践
指导思想：延长稳定期。 措施： 1.调节pH； 2.注意降温、通风； 3.中和排除有毒代谢产物； 4.稳定期是生产收获时期，注意把握好收获时机。
（4）衰亡期（老年）
死亡率＞出生率 ？ 细胞畸形 细胞死亡,出现自溶 有的微生物细胞产生或释放出一些产物。 如氨基酸、转化酶、抗生素等。现象。
单细胞微生物典型生长曲线
生 长 速 + 率 0 指 数 期
延滞期 指数期 稳定期 衰亡期
_
菌 数 目 的 对 数 值
延 滞 期
总菌数
稳定期
衰 亡 期
活菌数
0 时间t
微生物的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时 方便，0-10代表1～1010
（1）延滞期－“万事开头难”
特征： 代谢活跃，个体体积、重量增加，
（2）指数期（青年）
快，平均代时（繁殖一代的时间）最短， 生长速率常数最大。 细胞的化学组成、形态、生理特性比较一致。
06第六章 微生物的生长及控制
1. 微生物生长繁殖的pH值
大多数细菌、放线菌喜欢生活在中性偏碱的环境中， 细菌最适的pH在7.0~8.0之间，放线菌的最适pH在7.5~8.5 之间； 而酵母菌和霉菌刚好相反，适合在偏酸的条件下生 长，霉菌的最适pH值在4.0~5.8之间，酵母菌在3.8~6.0之 间。
2. pH值对微生物生长的影响
稀释倒平板法
操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！
2. 膜过滤培养法
菌数低的样品（如水）→ 膜过滤 → 培养 → 菌落计数
3. 显微镜直接计数法
缺点：
① 不能区分死菌与活菌 ② 不适于对运动细菌的计数 ③ 需要相对高的细菌浓度 ④ 个体小的细菌在显微镜下难以观察
4. 比浊法
5. 重量法
为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？
氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧 离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过 氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过 程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化 物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由 基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧 气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能 合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。
将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净， 然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其 干重。一般来说，干重约为湿重的10~20%，即 1mg干菌 = 5~10mg湿菌 = 4~5×109个菌体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6.氮量法(生理指标法)
微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以 常作为生长量的指标。如细菌含氮量约为菌体 干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白 质含量。
微生物学-第六章 微生物的生长及其控制
步骤：
菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜 培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始 洗脱液 后就可 以得 到刚刚分裂下来 的新生细胞， 即为同步培养。
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二、单细胞微生物的典型生长曲线
1.平板菌落计数法
最常用的活菌计数法。将适当稀释的菌液倾注平板 或涂布在平板表面，经适当温度培养后，以平板上出 现的菌落数乘以稀释度就可计数出原菌液的含菌量。 直径9cm 的平板上出现菌落数一般以50～500个为 宜。按照国家标准规定的样品菌落数总数测定的计数 原则，以平板菌落数在30～300个之间为报告依据。 适用范围： 中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微 生物。
生长曲线概念： 定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的 实验曲线，称为生长曲线。 生长曲线的制作： 把少量纯种单细胞微生物接种到一定体积的培养液 中后，在适宜的条件下培养，如果以细胞数目的对数 值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以绘制出分 批培养条件下微生物的生长曲线。
每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长 过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为 四个时期，即迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
技术要求： 样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操 作），严格无菌操作； 注意事项： 每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理， 倾注平板时的培养基温度； 误差： 多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样 品内菌体分布不均匀、以及不当操作。
2. 液体稀释法
对样品做10倍连续稀释，从适宜的3个连续稀 释度 中各取5ml 试 样，接 种 3组共9 支装有培养液 的试管中（每管接入1ml ）。经培养后，记录每个 稀 释 度 出 现 生 长 的 试 管 数 ， 然 后 查 M.P.N. 表 （most probable number，最大可能数），根据 样品稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。
微生物第六章总结
实验室中常用的好氧菌培养法有以下几类：（1）试管液体培养（2）三角瓶浅层液体培养（3）摇甁培养：又称振荡培养（4）台式发酵罐
2.厌氧菌的液体培养：厌氧罐，厌氧手套箱。
二， 生产实践中培养微生物的装置
（一）固态培养法
1.好氧菌的曲法培养
通风曲：是一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业种广泛应用。
衰亡期的原因有：外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。
三， 微生物的连续培养
连续培养：又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养或密闭培养而言的。
1.连续培养的类型：（1）按控制方式分<1>恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养。<2>恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于某最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。
3.生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。
（三）稳定期：又称恒定期或最高生长期。特点是：生长速率常数R等于零，处在新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等。
1. 生长产量常数Y（生长得率）可表示菌体产量与营养物的消耗关系：y=x-x0/c0-c=x-x0/c0（x为稳定期的细胞干重g/mL，x0为刚接种时的细胞干重，c0为限制性营养物的最初浓度g/mL，c为稳定期时限制性营养物的浓度）
（2）按培养器级数分：单级连续培养器和多级连续培养器两类。
2.连续培养用于生产实践称为连续发酵。连续发酵与单批发酵相比优点是：（1）高效（2）自控（3）产品质量较稳定（4）节约了大量动力。缺点是：（1）菌种易退化（2）易污染杂菌。
2.厌氧菌的液体培养：厌氧罐，厌氧手套箱。
二， 生产实践中培养微生物的装置
（一）固态培养法
1.好氧菌的曲法培养
通风曲：是一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业种广泛应用。
衰亡期的原因有：外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。
三， 微生物的连续培养
连续培养：又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养或密闭培养而言的。
1.连续培养的类型：（1）按控制方式分<1>恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养。<2>恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于某最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。
3.生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。
（三）稳定期：又称恒定期或最高生长期。特点是：生长速率常数R等于零，处在新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等。
1. 生长产量常数Y（生长得率）可表示菌体产量与营养物的消耗关系：y=x-x0/c0-c=x-x0/c0（x为稳定期的细胞干重g/mL，x0为刚接种时的细胞干重，c0为限制性营养物的最初浓度g/mL，c为稳定期时限制性营养物的浓度）
（2）按培养器级数分：单级连续培养器和多级连续培养器两类。
2.连续培养用于生产实践称为连续发酵。连续发酵与单批发酵相比优点是：（1）高效（2）自控（3）产品质量较稳定（4）节约了大量动力。缺点是：（1）菌种易退化（2）易污染杂菌。
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将已知颗粒浓度的样品与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下 根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。
过滤计数：
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显 微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；
活菌计数：
采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数
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获得同步生长的方法：
环境条件控制技术 温度 培养基成份控制 其他（如光照和黑暗交替培养） 离心方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法
机械方法
同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传 特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。
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4、显微镜直接计数法
1）常规方法： 取定容稀释的单细胞微生物(细菌)悬液 放置在计数板上，在显微 镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供试样品的细胞数。
缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察
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Hale Waihona Puke ）其它方法： 比例计数：迟缓期出现的原因：调整代谢 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：
(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；
(2)利用对数生长期的细胞作为种子； (3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量
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对数生长期(Log phase)：
又称指数生长期(Exponential phase)，在生长曲线中，紧接着迟 缓期的一段细胞数以几何级数增长的时期。 对数生长期特点： 平衡生长； 酶系活跃、代谢旺盛；生长速率常数R最大、代 时最短。 是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种 子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。
在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是 实现微生物连续培养的基本原则。
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二、连续培养(Continous culture ）
恒浊连续培养 控制连续培养的方法
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一、以数量变化对微生物生长情况进行测定
1、培养平板计数法：广泛用于各种样品的检测
方法：（1）涂布法（菌长在表面） （2）倾注法（菌长在表面和 基内） 优点：常用、较准确、可对不同种微 生物做活菌计数。 缺点： 时间长、人为误差大，有机 械损伤。
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硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法
由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随 后又逐渐转变为随机生长。
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第三节 微生物的培养方法
微生物培养技术的发展的特点：
1. 少量培养 → 大规模培养 2. 浅盘培养 → 厚层固体或深层（液体）培养 3. 以固体培养为主 → 以液体培养为主 4. 静止式液体培养 → 通气搅拌式液体培养 5. 分批培养 → 连续培养 → 多级连续培养 6. 游离的微生物细胞培养 → 利用固定化细胞培养 7. 单一微生物培养 → 混合微生物培养
营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过 新生速率，整个群体呈现出负增长。
细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些 产物，如抗生素等。
在实际工作中多采用分光光度计测 定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。
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二、连续培养(Continous culture ）
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连续培养的优点
1、缩短发酵周期，提高设备的利用率； 2、便于自控。降低动力消耗及劳动强度； 3、产品均一。
连续培养的缺点： 易杂菌污染；菌种易退化
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恒化培养和恒浊培养的比较
装 置 恒 浊 器 恒 化 器 控制 对象 菌体 密度 生长限 制因子 无 培养液 流速 不恒定 生长 速率 最高生 长速率 产物 应用 范围 生产 为主
一、单细胞微生物的典型生长曲线
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根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，一 条典型的生长曲线至少可以分为： 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期
1. 迟缓期(Lag phase)：
将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即 增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。
不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定
恒化连续培养
保持恒定的流速,使营养物质浓度保持恒定
连续培养装置示意图
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(一）恒化连续培养
概念：以恒定流速使营养物质浓 度恒定而保持细菌生长速率恒定 的方法。微生物始终在低于其最 高生长速率下进行生长繁殖。
原理：恒化器中动态平衡的稳定 性，是以某种生长限制因子（如 碳、氮源；生长因子；无机盐等） 的浓度来控制菌的生长速度。 特点：维持营养成分的低浓度， 控制微生物生长速率。
一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。
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2、膜过滤培养法
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用 水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进 行培养，对形成的菌落进行统计。
迟缓期的特点：
细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，
细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的 细菌细胞体积最大 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核 糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。
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3、液体法
将待测样品做系列稀释，培养后，根据没生长的最低稀释度 和出现生长的最高稀释度，应用“或然率”理论，计算出样 品单位体积中细胞的近似值。最高稀释度称为临界级数，从 3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可 靠的结果。
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3. 稳定生长期(Stationary phase)：
由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不 适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零。
稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌 数最高并维持稳定。
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4. 衰亡期(Decline或Death phase)：
8. 野生菌种 → 变异菌株、“工程菌”
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微生物培养法
1 固体培养 2 液体培养 3 连续培养 4 补料分批培养
5
混合培养
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一、固体培养(Solid-state culture)
（一）实验室常见的固体培养 1. 好氧菌培养 试管斜面(test-tube slant) 培养皿平板 克氏扁瓶(kolle flask) 茄子瓶斜面
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2. 厌氧菌培养
厌氧装置 + 特殊培养基 六大营养素 + 还原剂 氧化还原势指示剂， 如刃天清(resazuin)
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厌氧菌培养的装置：
（1） Hungate滚管技术 1950年美国微生物学家R.E.Hungate设计
（2）厌氧培养皿
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食品微生物学
南京农业大学食品科技学院
第 六 章 微生物的生长及其控制
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
微生物生长的测定 微生物的群体生长规律 微生物的培养方法 影响食品中微生物生长的因素 食品中微生物控制的原理和方法
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生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体 体积扩大的生物学过程。 繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
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（二）恒浊连续培养
概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保 持恒定的连续培养方法。 原理：维持菌浓度不变。 特点：基质过量，菌以最高速率生长；但工艺复杂，烦琐。
在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊 度(即菌液浓度)，并根据光电效应产生的电信号的强弱变化， 自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。
厌氧菌培养的装置：
（3）厌氧罐 （4）厌氧手套箱
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（二）生产中常见的固体培养
1.好氧菌的曲法培养
曲盘、转鼓、通风曲槽等
2.厌氧菌的堆积培养法
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二、液体培养(Liquid-state culture)
液体培养提高溶氧速率的措施：
浅层培养(Shallow liquid culture) 摇床:振荡培养(Shaking flask culture) 深层培养(Submerged culture)
G= 1/R=t2-t1/3.322（lgX2-lgX1）
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影响微生物增代时间（代时）的因素
1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短； 3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比； 凡是处于较低 浓度范围内， 可影响生长速 率的营养物成 分，就称为生 长限制因子。 4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。
过滤计数：
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显 微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；
活菌计数：
采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数
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获得同步生长的方法：
环境条件控制技术 温度 培养基成份控制 其他（如光照和黑暗交替培养） 离心方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法
机械方法
同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传 特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。
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4、显微镜直接计数法
1）常规方法： 取定容稀释的单细胞微生物(细菌)悬液 放置在计数板上，在显微 镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供试样品的细胞数。
缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察
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Hale Waihona Puke ）其它方法： 比例计数：迟缓期出现的原因：调整代谢 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：
(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；
(2)利用对数生长期的细胞作为种子； (3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量
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对数生长期(Log phase)：
又称指数生长期(Exponential phase)，在生长曲线中，紧接着迟 缓期的一段细胞数以几何级数增长的时期。 对数生长期特点： 平衡生长； 酶系活跃、代谢旺盛；生长速率常数R最大、代 时最短。 是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种 子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。
在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是 实现微生物连续培养的基本原则。
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二、连续培养(Continous culture ）
恒浊连续培养 控制连续培养的方法
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一、以数量变化对微生物生长情况进行测定
1、培养平板计数法：广泛用于各种样品的检测
方法：（1）涂布法（菌长在表面） （2）倾注法（菌长在表面和 基内） 优点：常用、较准确、可对不同种微 生物做活菌计数。 缺点： 时间长、人为误差大，有机 械损伤。
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硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法
由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随 后又逐渐转变为随机生长。
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第三节 微生物的培养方法
微生物培养技术的发展的特点：
1. 少量培养 → 大规模培养 2. 浅盘培养 → 厚层固体或深层（液体）培养 3. 以固体培养为主 → 以液体培养为主 4. 静止式液体培养 → 通气搅拌式液体培养 5. 分批培养 → 连续培养 → 多级连续培养 6. 游离的微生物细胞培养 → 利用固定化细胞培养 7. 单一微生物培养 → 混合微生物培养
营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过 新生速率，整个群体呈现出负增长。
细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些 产物，如抗生素等。
在实际工作中多采用分光光度计测 定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。
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二、连续培养(Continous culture ）
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连续培养的优点
1、缩短发酵周期，提高设备的利用率； 2、便于自控。降低动力消耗及劳动强度； 3、产品均一。
连续培养的缺点： 易杂菌污染；菌种易退化
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恒化培养和恒浊培养的比较
装 置 恒 浊 器 恒 化 器 控制 对象 菌体 密度 生长限 制因子 无 培养液 流速 不恒定 生长 速率 最高生 长速率 产物 应用 范围 生产 为主
一、单细胞微生物的典型生长曲线
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根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，一 条典型的生长曲线至少可以分为： 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期
1. 迟缓期(Lag phase)：
将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即 增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。
不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定
恒化连续培养
保持恒定的流速,使营养物质浓度保持恒定
连续培养装置示意图
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(一）恒化连续培养
概念：以恒定流速使营养物质浓 度恒定而保持细菌生长速率恒定 的方法。微生物始终在低于其最 高生长速率下进行生长繁殖。
原理：恒化器中动态平衡的稳定 性，是以某种生长限制因子（如 碳、氮源；生长因子；无机盐等） 的浓度来控制菌的生长速度。 特点：维持营养成分的低浓度， 控制微生物生长速率。
一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。
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2、膜过滤培养法
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用 水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进 行培养，对形成的菌落进行统计。
迟缓期的特点：
细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，
细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的 细菌细胞体积最大 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核 糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。
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3、液体法
将待测样品做系列稀释，培养后，根据没生长的最低稀释度 和出现生长的最高稀释度，应用“或然率”理论，计算出样 品单位体积中细胞的近似值。最高稀释度称为临界级数，从 3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可 靠的结果。
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3. 稳定生长期(Stationary phase)：
由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不 适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零。
稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌 数最高并维持稳定。
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4. 衰亡期(Decline或Death phase)：
8. 野生菌种 → 变异菌株、“工程菌”
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微生物培养法
1 固体培养 2 液体培养 3 连续培养 4 补料分批培养
5
混合培养
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一、固体培养(Solid-state culture)
（一）实验室常见的固体培养 1. 好氧菌培养 试管斜面(test-tube slant) 培养皿平板 克氏扁瓶(kolle flask) 茄子瓶斜面
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2. 厌氧菌培养
厌氧装置 + 特殊培养基 六大营养素 + 还原剂 氧化还原势指示剂， 如刃天清(resazuin)
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厌氧菌培养的装置：
（1） Hungate滚管技术 1950年美国微生物学家R.E.Hungate设计
（2）厌氧培养皿
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食品微生物学
南京农业大学食品科技学院
第 六 章 微生物的生长及其控制
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
微生物生长的测定 微生物的群体生长规律 微生物的培养方法 影响食品中微生物生长的因素 食品中微生物控制的原理和方法
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生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体 体积扩大的生物学过程。 繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
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（二）恒浊连续培养
概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保 持恒定的连续培养方法。 原理：维持菌浓度不变。 特点：基质过量，菌以最高速率生长；但工艺复杂，烦琐。
在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊 度(即菌液浓度)，并根据光电效应产生的电信号的强弱变化， 自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。
厌氧菌培养的装置：
（3）厌氧罐 （4）厌氧手套箱
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（二）生产中常见的固体培养
1.好氧菌的曲法培养
曲盘、转鼓、通风曲槽等
2.厌氧菌的堆积培养法
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二、液体培养(Liquid-state culture)
液体培养提高溶氧速率的措施：
浅层培养(Shallow liquid culture) 摇床:振荡培养(Shaking flask culture) 深层培养(Submerged culture)
G= 1/R=t2-t1/3.322（lgX2-lgX1）
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影响微生物增代时间（代时）的因素
1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短； 3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比； 凡是处于较低 浓度范围内， 可影响生长速 率的营养物成 分，就称为生 长限制因子。 4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。