高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育

活力不高，因此，利用各种诱变手段选育高产纤维 素酶生产菌一直是国内外研究的热点。 本研究通过 化学诱变剂 NTG、硫酸二乙酯和 LiCl 对一株黑曲霉 菌株进诱变，获得了纤维素酶活性显著提高且遗传 性状稳定的突变株。
1 材料与方法
1．1 材料 1．1．1 出发菌株 黑曲霉 （Aspergillus niger F1）， 本实验室分离保存。 1．1．2 培养基 ①斜面培养基（PDA 培养基）：马铃
选育出 1 株纤维素酶高产菌株 L1。 在适宜条件下，其产 CMCase 活力为出发菌株的 150．2％。
关键词：纤维素酶；化学诱变；黑曲霉
中 图 分 类 号 ：Q933
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2009）01－0088-03
Breeding of High-Yield Cellulase Aspergillus niger Mutated by Chemicals
（自 然 科 学 版 ），2006 ，45 （2）：272－276． ［9］ SOLOMON E I， SUNDARAM U M， MACHONKIN T E．
Multicopper oxidases and oxygenases ［J］． Chem Rev， 1996，96：2563－2605． ［10］ TONER B， FAKRA S， VILLALOBOS M， et al． Spatially Resolved Characterization of Biogenic Manganese Oxide Production within a Bacterial Biofilm ［J］． Appl Environ Microbiol， 2005，71（3）：1300－1310．
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湖 北 农 业 科学
2009 年
致 死 率 接 近 100％。 选 择 在 50％～90％致 死 率 范 围 内 ，挑 取 Hc＞1．5 的 菌 株 10 株 ，斜 面 培 养 后 液 体 发 酵 ，并 测 CMCase 活 力 ，结 果 见 表 2。 由 表 2 可 知 ， DES 诱变后 D8 菌株相对酶活最高，所以选 D8 菌株 为下一轮诱变的出发菌株。
2 结果与分析
2．1 NTG 诱变致死率及突变株的筛选 以黑曲霉菌株 F1 为出发菌株，经 NTG 诱变 5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min 后 ， 涂 布 于分离培养基，28℃培养 4～5 d，计算菌落数。 孢子 致死率与时间的关系见图 1。 处理 50 min 左右，孢 子致死率接近 100％。 选择在 50％～90％致死率范围 内 ，挑 取 Hc＞1．5 的 菌 株 10 株 ，斜 面 培 养 后 液 体 发 酵 ，并 测 CMCase 活 力 ，结 果 见 表 1。 由 表 1 可 知 ， NTG 诱变后 N2 菌株相对酶活最高， 所以选 N2 菌 株为下一轮诱变的出发菌株。
第 48 卷第 1 期 2009 年 1 月
湖北农业科学 湖Hube北i Agri农cultura业l Scie科nces 学
Vol． 48 No.1 J2a0n0．，92年009
高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育
冯培勇，宿红艳，张 丽，王艳华 （鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025）
摘要：以 1 株黑曲霉（Aspergillus niger F1）为出发菌株，经过 亚 硝 基 胍 、硫 酸 二 乙 酯 和 氯 化 锂 诱 变 处 理 ，
mineral forming elements ［C］． Amsterdam： Elsevier，1979． 253－292． ［6］ NEALSON K H． The microbial manganese cycle ［A］． KRUMBEIN W E． Microbial geochemistry ［C］． Oxford： Blackwell Scientific Publications，1983．191－221． ［7］ TEBO B M， BARGAR J R， CLEMENT B G， et al． Biogenic manganese oxides： properties and mechanisms of formation ［J］．Annu． Rev． Eath． Planet Sci，2004，32：287－328． ［8］ 田美娟，邵宗泽．深海抗 锰 细 菌 的 分 离 鉴 定 ［J］．厦 门 大 学 学 报
min， 再各加入稀释 5 倍后的酶液 0．5 mL，50℃水浴 30 min 后取出， 立即向 2、3、4 号试管中各加入 1．5 mL DNS 溶液以终止酶反应， 充分摇匀后沸水浴 5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至 20 mL，充分混匀。 在 540 nm 波长下测定 2、3、4 号试管液的光密度值 并记录结果 。 ［7，8］ 根据 3 个重复光密度值的平均值， 在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，计算出 CMCase 酶 活 力 （U·mL－1），在 上 述 条 件 下 ，每 分 钟 由 底 物生成 1 μg 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力 单位（U）［9］。
FENG Pei－yong，SU Hong－yan，ZHANG li，WANG Yan－hua （College of Life Science， Ludong University Yantai 264025，Shandong，China）

Abstract： A strain， Aspergillus niger F1， was used as starting strain and mutated by NTG ， DES and LiCl． The strain named L1 was bred which could produce high－yield cellulase． Under suitable conditions ， its CMCase activity was 150．2％ of the starting strain． Key words：cellulase；chemical mutatation；Aspergillus niger
收 稿 日 期 ：2008－10－18 基 金 项 目 ：鲁 东 大 学 基 金 项 目 （20053305 ） 作者简介：冯培勇（1977－），男，山东日照人，硕士，主要从事微生物产酶的研究工作，（电话）13220936411（电子信箱）fengpeiyong2004＠yahoo．com．cn。
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（责任编辑 郑 威）
第1期
冯培勇等：高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育
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薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，水 1 000 mL，pH 自 然 ［4］。 ② 筛 选 培 养 基 （ 质 量 分 数 ，％ ）：KH2PO4 0．1， （NH4）2SO4 1，MgSO4·7H2O 0．025，CMC－Na 1， 去 氧 胆 酸 钠 0．25，刚 果 红 0．02，琼 脂 2．0，pH 自 然 ；③发 酵 培 养 基 ： 麸 皮 1 g，KH2PO4 2 g，（NH4）2SO4 1．4 g， MgSO4 0．3 g，CaCl2 0．34 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO4· H2O 1．6 mg，ZnSO4·7H2O 1．4 mg，CoCl2 2．0 mg， 定容 到 1 L，pH 自然。 1．2 方法 1．2．1 孢子悬浮液制备 从新长成的斜面用 pH 值 7．0 磷 酸 缓 冲 液 洗 下 孢 子 ， 以 磁 力 搅 拌 器 搅 拌 20 min， 打散孢子后显微镜记数， 并调节孢子浓度至 106 个·mL－1［5］。 1．2．2 亚硝基胍 （NTG） 诱变 取 28℃培养 5 d 的 F1 菌种斜面， 按 1．2．1 制备孢子悬浮液。 取孢子液 10 mL，加入 10 mL NTG（4 mg·mL－1），28℃恒温振荡 处 理 5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60 min 后 ， 适当稀释， 涂布于分离培养基平板，28℃培养 4～5 d 后，进行菌落计数并计算致死率。致死率（％）＝（对照 菌落数－处理菌落数） ／ 对照菌落数×100％。 1．2．3 硫 酸 二 乙 酯 （DES）诱 变 选 取 经 NTG 诱 变 后酶活最高的突变株为出发菌株， 按 1．2．1 制备孢 子悬浮液。 取 16 mL pH 值 7．0 的磷酸缓冲液、4 mL 孢子悬浮液、0．2 mL DES 原液充分混合 （DES 的终 体 积 分 数 为 1％ ，），28℃ 恒 温 分 别 振 荡 处 理 5、10、 15、20、25、30、40、45、50、55、60 min 后，分别于 1 mL 处 理 液 中 加 入 0．5 mL 25％Na2S2O3 溶 液 终 止 反 应 ， 适当稀释后，涂布于分离培养基平板，28℃培养 4～5 d 后，进行菌落计数并计算致死率。 1．2．4 氯 化 锂 （LiCl）诱 变 取 经 DES 诱 变 后 酶 活 最高的突变株为出发菌株，制成浓度为 107 个·mL－1 菌悬液涂布在分别含有 0、0．1％、0．3％、0．5％、0．7％、 0．9％、1．1％、1．3％的 LiCl 分离培养基平板上，28℃培 养 4～5 d，进行菌落计数并计算致死率。 1．2．5 突 变 株 的 筛 选 选 取 纤 维 素 水 解 圈 与 菌 落 直径之比大于 1．5（Hc＞1．5）的菌落接种于斜面培养 基上培养 4～5 d 后，接种到发酵培养基中，28℃培养 120 h 后测定酶活。 将每一轮诱变所筛选到的最高 酶活突变株，作为下一轮诱变的出发菌株。 1．2．6 粗 酶 液 制 备 取 适 量 发 酵 液 ，5 000 r·min－1 离心 10 min，上清液即为粗酶液。 1．2．7 CMCase 活力的测定［6］ 以 CMC 为底物测定。 取 4 支洗净烘干的具塞刻度试管， 编号后各加入 1．5 mL 0．51％ CMC 柠檬酸缓冲液， 并向 1 号试管 中加入 1．5 mL DNS 溶液以钝化酶活性， 作为空白 对 照 。 将 4 支 试 管 同 时 在 50℃ 水 浴 中 预 热 5～10