蜡样芽胞杆菌的检验

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（4）与类似菌鉴别 • 本菌与其他类似菌的鉴别见表2。
呕吐型中毒：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性 肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2～3小时，最短 为30分钟，最长5～6小时；症状以呕吐，腹痉挛为主， 腹泻则少见，一般经过8～10小时而治愈。
腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜 伏期在6小时以上，一般为6～14小时；症状以腹泻，腹 痉挛，而呕吐却不常见；病程24～36小时。
形态观察 染色镜检
证实试验
培养特性
生化特性 生化分型
报告
2．菌数测定 • 以无菌操作将检样25g或25 ml按菌落总数测定方式，用 灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液。 取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多 黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，臵 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计 数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表 示不发酵甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示 产生卵磷脂酶）。
上的菌落为粉红色(表示不发 酵甘露醇)，周围有粉红色的 晕（表示产生卵磷脂酶）。
（5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁 环，振摇易乳化。
3、生化性状：
（1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中， 厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变 为黄色。（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸） （2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。 （3） V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃ 培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止 1h，应为阳性反应（伊红色）。
化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；
能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵 葡萄糖。
四、实验结果
根据以上实验作出检验报告。
五、思考题
1．如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢 杆菌？ 2．设计蜡样芽孢杆菌计数程序？
4．证实试验
（1）形态观察 本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上， 芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中 央或稍偏于一端。 （2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧
碱不敏感，pH6-11对本菌基本上不受影响，pH5以
下，生长可受到抑制。
（二）流行病学特点
1、季节性特点： 以夏、秋季，尤其是6～10月为多见。 2、食品种类 －剩饭，特别是大米饭。 －乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、 豆芽、甜点心、调味汁、色拉。 国内：与淀粉质食品相关多。
3、临床症状
• 计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根 据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该 培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数 即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。
选取具有15-150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板 ,进行计数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。
计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验，根据证实 的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然 后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞 杆菌数。
（4）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培
养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培
养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白
酶）。阴性时应继续培养72 h再观察。 （5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液
一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h。 该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
三、实验方法与步骤
1．蜡样芽孢杆菌检验程序
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水 或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在
选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个
表面，置37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。 蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）,
4、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌 外，肠毒素也是重要的致病因素。
耐热性肠毒素：100℃30分钟不能被破坏，为引起呕吐 型中毒的致病因素,常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成。
5、抵抗力
蜡样芽胞杆菌100 ℃ 20分钟即可被杀死；对酸
环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑
取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数， 计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或 每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。
3．分离培养
将检样或其稀释液划线于上述选择性培 养基平板上，置37℃培养12～20h，挑取 可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营 养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试 验。
例如将0.1mL 10-4样品稀释液涂布于MYP平板上，其可疑 菌落为25个，取5个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌， 则1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：
25×4/5×104×10＝2×106
3．分离培养 • 将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上， 臵37℃培养12～20h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌 落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后 做证实试验。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状
1、形态和染色特性 该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽
胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列,
无荚膜，有周鞭毛。
2、培养特性
（1）需氧菌，生长温度范围在10-45℃之间。最适 生长温度为28-35℃。
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
10-1~10-5的 稀释液的制备
每个稀释度 36±1℃ 菌落计数 0.1mL接种于2个 12~20h MYP培养基
36±1℃ 12~20h
挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）
4．证实试验 （1）形态观察 • 本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵 圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。 （2）培养特性 • 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。 琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状 或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
• 本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化 氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能 液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡 萄糖。
（三）检测方法
检样 25g(ml)+225ml生理盐水
1.蜡样芽孢杆菌检验程序：
做成10-1-10-5的稀释液 37℃，18h-24h 选择性培养基（菌数测定） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 菌数计算 生长及菌落观察
中华人民共和国国家 标准食品卫生微生物 学检验蜡样芽孢杆菌 检验GB/T 4789.282003
5.结果报告
• 报告1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量[个 /g(mL)]。
实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验
一、实验目的
1．学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。
2．了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特
性和生化特性。
二、实验原理
蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰 氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正 常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种 食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、 蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、 阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇,卵磷脂酶和 酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能 在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条 件下能发酵葡萄糖。
(4)生化分型 • 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐 还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化的试 验，分成不同型别，见表1。
表1
型 别
蜡样芽孢杆菌生化分型
生 化 试 验 V-P反应 明胶液化
柠檬酸盐利用
硝酸盐还原 淀粉水解
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
（2）在普通培养基上生长良好。
本菌在普通琼脂平板上，生长
的菌落呈乳白色，不透明，直
径4-6mm,边缘不整齐，表面粗 糙，呈毛玻璃状或白蜡状。
（3）在血液琼脂平板上形成 浅灰色、不透明、似毛玻璃 状的菌落。菌落周围初呈草 绿色溶血,时间稍长即完全透
明。
（4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇
卵黄多粘菌素琼脂(MYP)