致病菌检验-蜡样芽孢杆菌.
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，它可以生长在食品和环境中，因此对于食品和饮料行业来说，蜡样芽孢杆菌的检测非常重要。
国际上已经制定了相关的标准，而国内也制定了具体的检测方法。
本文将介绍蜡样芽孢杆菌国标检测方法并展开详细描述，以供相关行业参考。
1. 国标检测方法蜡样芽孢杆菌国标检测方法主要采用了生物学检测和分子生物学检测方法。
生物学检测主要使用平板计数法和过滤膜法，分子生物学检测主要使用聚合酶链式反应法（PCR法）和实时荧光定量PCR法（qPCR法）。
2. 样品选择需要检测的样品包括：发酵食品、膳食补充剂、调味品、果蔬制品、肉制品和乳制品等。
3. 样品制备样品制备前应先进行预处理。
首先采样应在保持样品原有状态的基础上进行。
对于固体样品，应采用加热处理或浸泡法进行分离；对于液体样品，应使用过滤方法或离心沉淀法进行分离。
4. 平板计数法平板计数法是指直接将样品加入含有富含营养物质的寒天平板中，将平板培养在适宜的环境中，形成菌落后进行计数。
整个操作过程需要消毒操作标本及工具，取样后用无菌吸管挤压或邀约样本，点样于寒天平板上，用无菌毛细管在菌液上滴蒸馏水，最后在恰当条件下培养。
5. 过滤膜法过滤膜法将膜片放入模具上，加入样品后进行过滤，将膜片放入含营养物质的寒天平板中，使其形成菌落后，进行计数。
操作过程中需要对膜片进行密封操作以避免空气污染。
6. PCR法PCR法是指从样品中提取DNA，并使用特定引物进行扩增，在扩增过程中计量目的DNA 的含量。
PCR方法的核心技术是产生大量DNA分子复制，以此来检测目标DNA。
7. qPCR法qPCR法是指通过PCR法产生信息荧光信号，以定量检测目标DNA的含量。
qPCR法和PCR法类似，都是通过DNA扩增并检测扩增产物来判断样品是否含有目标DNA。
8. 标准限值国标GB 4789.38-2016中规定蜡样芽孢杆菌在各类食品和饮料中的限值分别为100CFU/g和10CFU/mL，不得检出则符合标准。
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
用孔雀绿染色的蜡样芽孢杆菌芽孢
（三）、生化反应
1、能分解GLU，麦芽糖，蔗糖，水杨 苷，产酸不产气。
2、不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖， 山梨醇，木糖
3、H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂 酶（+），V—P试验（+），液化明胶， 胨化中乳。
（三）、生化反应
▪ 麦芽糖：阳性
用孔雀绿染色的蜡样芽孢杆菌芽孢 1、需氧，最适生长30—32℃. 国内480件中有221件阳性，阳性率46%； 国内480件中有221件阳性，阳性率46%； 第二节 食品中蜡样芽孢杆菌的检验 如MYP平板上的可以菌落为25个，取5个鉴定，证实为四个，乘上稀释倍数（104），再乘上1g(ml)检样数（取的是0. 用孔雀绿染色的蜡样芽孢杆菌芽孢 根据证实为蜡状芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以稀释倍数，即得每g(ml)样品中所含蜡状芽孢杆菌数。 2、蜡样芽胞杆菌的形态与染色特性如何。 （二）蜡样芽胞杆菌的食物中毒的一般情况
摇易乳化。 3、在普通琼脂平板上，菌落灰白色,不透
明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃 状或白蜡状。
1ml，接种在两个选择性培养基—甘露醇卵黄多孢菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形涂棒涂布于整个表面，置36±1℃恒温箱培养 1220h后选取适当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示 产生卵磷脂酶）。
3、中毒与性别、年龄无关：
一、生物学特性 1、能分解GLU，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
以无菌操作将检样25g(ml),用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1—10-5的稀释液。 腹泻 8h后 3、中毒与性别、年龄无关： （二）蜡样芽胞杆菌的食物中毒的一般情况
蜡样芽孢杆菌检测国标
蜡样芽孢杆菌检测国标蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病微生物，它会引起食物中毒的发生。
针对蜡样芽孢杆菌的检测方法，我国制定了相关国家标准，本文将从以下三个方面进行介绍。
一、蜡样芽孢杆菌简介
蜡样芽孢杆菌又称为蜡样芽孢菌（Bacillus cereus），是一种革兰氏阳性菌。
其孢子分布广泛，可以在空气、土壤、水、食品等各种环境中存活，甚至在高温加工食品中也可以存活。
蜡样芽孢杆菌是一种致病微生物，能够引起急性食物中毒，这是因为它产生的毒素能够影响肠胃道，引起呕吐、腹泻等症状。
二、蜡样芽孢杆菌检测国标
为了保障人们的食品安全，我国对食品中的蜡样芽孢杆菌进行了规范化的检测方法，主要是通过标准的培养及鉴定步骤进行。
1.样品采集：首先需要确定样品的种类，其次选择适当的采集方法，例如在市场上购买的食品需要在废弃部位进行采集，以保障采样的准确性。
2.样品处理：将采集到的食品样品进行前处理，包括样品的清洁去除外部污染等步骤。
3.菌液制备：将采样到的食品样品用合适的培养基进行培养，培养出的菌落进行鉴定，得到蜡样芽孢杆菌后进行菌液制备。
4.检测方法：采用PCR法、生物分子方法、蛋白质检测法等方式对菌液进行检测，以确认菌液中是否有蜡样芽孢杆菌存在。
5.结果判定：判定样品中是否存在蜡样芽孢杆菌，并进行定性和定量分析。
三、总结
蜡样芽孢杆菌检测国标对食品安全有着重要的意义，它通过科学、规范的检测方法保障了人们的食品安全。
在实际操作中，应加强样品采集及前处理，保证样品的准确性。
同时，为了提高检测的灵敏度和准确性，应选择合适的检测方法。
最后，需要将检测结果进行有效记录，以便后续参考。
蜡样芽孢杆菌
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）一、生物学特征杆状菌体有成链趋向；链的稳固性决定了菌落的形态，在不一样的菌株中菌落形态变化很大。
一种特别的菌落为暗的或毛玻璃状，并有起伏的边沿，从边沿移出的生长物不发达国家育。
另一种特别性殊菌落，根状生长，在营养琼蜡样芽孢杆菌是需氧性、有运动性、能产生芽孢的革兰氏阳性大杆菌。
——摘自《伯杰细菌判定手册》，第八版，科学第一版社， P736蜡样芽孢杆菌是需氧性、有运动性、能产生芽孢的革兰氏阳性大杆菌。
蜡样芽孢杆菌常在以下产品中存在，如乳、肉、蔬菜、甜点心、调味汁、凉拌菜、炒饭等。
常常因不加热或加热不完整惹起食品中毒。
——摘自《高温杀菌产品蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制举措》，李钧等，中国食品与营养，2007 年第 8 期，P25-27二、防治举措蜡样芽孢杆菌耐热，使肉汤中细菌×107/ml) 转为阴性需100℃20min。
其游离芽胞能耐受100℃30min，而干热灭菌需120℃60min 才能杀死。
蜡样芽胞杆菌在4℃、、盐浓度 18％的条件下还能存活或生长。
经过高温杀菌或适合的冷藏能够控制蜡样芽胞杆菌的增殖。
未产芽孢的蜡样芽孢杆菌100℃经 20min 菌体可被杀死。
——摘自《高温杀菌产品蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制举措》，李钧等，中国食品与营养，2007 年第 8 期，P25-27三、药敏试验含 250 mg/L 的二氧化氯作用 min ，对蜡样芽孢杆菌的杀灭对数值为； 750 mg/L 的二氧化氯作用 min ，对蜡样芽孢杆菌的杀灭对数值 >。
用 150mg/L 的过氧乙酸作用 15 min，对蜡样芽孢杆菌的杀灭对数值为； 2000 mg/L 的过氧乙酸作用 min ，对蜡样芽孢杆菌的杀灭对数值 >。
10 g/L 的过氧化氢作用，对蜡样芽孢杆菌的杀灭对数值为 2 .12 ； 15 g/L 的过氧化氢作用，对蜡样芽孢杆菌的杀灭对数值为。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
蜡样芽孢杆菌检测标准
蜡样芽孢杆菌检测标准蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的细菌，广泛存在于土壤、水、空气和食品中。
它是一种厌氧菌，在适宜的条件下能够迅速生长繁殖，因此对其检测标准十分重要。
蜡样芽孢杆菌的存在会对食品安全造成威胁，因为它可以产生多种毒素，其中包括引起食物中毒的致病毒素。
因此，对食品中蜡样芽孢杆菌的检测标准必须严格执行，以保障食品安全。
首先，蜡样芽孢杆菌的检测应该基于科学的方法和标准。
目前，国际上对蜡样芽孢杆菌的检测标准主要包括ISO标准和FDA标准。
ISO标准主要适用于食品和饮用水等领域，而FDA标准则更多地用于医药和化妆品等领域。
在执行检测时，应当严格按照相关标准进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
其次，蜡样芽孢杆菌的检测应该注重样品的采集和保存。
在采集样品时，应当避免外界污染，并选择适当的容器进行保存，以防止细菌的生长和繁殖。
同时，在运输和保存过程中，应当注意避免温度和湿度的变化，以确保样品的完整性和稳定性。
另外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测方法的选择和操作流程。
目前常用的检测方法包括培养法、PCR法和免疫学方法等。
在选择检测方法时，应当根据具体的检测对象和要求进行合理的选择，并严格按照操作流程进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
除此之外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测结果的解读和评估。
在获得检测结果后，应当根据相关标准和法规进行结果的解读和评估，以确定是否符合安全标准。
同时，还应当对检测过程中出现的异常情况进行分析和处理，以确保检测结果的真实性和可靠性。
总的来说，蜡样芽孢杆菌的检测标准对于保障食品安全至关重要。
在执行检测时，应当严格按照科学的方法和标准进行操作，注重样品的采集和保存，选择合适的检测方法并严格执行操作流程，最终对检测结果进行准确的解读和评估。
只有这样，才能有效地预防和控制蜡样芽孢杆菌对食品安全造成的威胁。
实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
4．证实试验
（1）形态观察
本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形， 不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操 作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗
（2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧 化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖； 能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵
葡萄糖。
A、 MYP平板实验
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 mL，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在两个选择培养基
（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
欧盟蜡样芽孢杆菌标准
欧盟蜡样芽孢杆菌标准1. 引言1.1 背景介绍蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一类能够生存于环境中的革兰氏阳性细菌，常见于土壤、灰尘和食品中。
这种细菌能够产生孢子，具有较强的耐热性和耐酸性，容易在食品加工过程中存活和繁殖。
蜡样芽孢杆菌引起的食品中毒是一种常见的食源性疾病，主要通过食用被污染的食品进入人体，引起胃肠道不适、腹泻、恶心等症状。
为了保障食品安全和公共健康，欧洲联盟制定了关于蜡样芽孢杆菌的标准，旨在规范食品生产过程中对蜡样芽孢杆菌的监测、控制和管理。
这些标准不仅要求食品生产企业对食品中的蜡样芽孢杆菌进行严格监测，还规定了相应的防控措施和应急处理措施。
通过遵守这些标准，可以有效减少蜡样芽孢杆菌引起的食品中毒事件，维护食品安全和公众健康。
欧盟蜡样芽孢杆菌标准的制定和执行对于提升食品安全水平至关重要。
2. 正文2.1 欧盟蜡样芽孢杆菌标准的制定欧盟蜡样芽孢杆菌标准是针对食品安全领域的一项重要标准，其制定过程经历了多方的协商和研究。
欧盟蜡样芽孢杆菌是一种常见的食品中毒菌，对人体健康造成危害，因此有必要确立相应的标准来规范其在食品中的含量。
制定欧盟蜡样芽孢杆菌标准的过程中，专家们首先对该菌种的生物学特性、生长环境等进行了深入研究，以确定其危害程度和影响范围。
在明确了标准的必要性后，欧盟相关部门组织了一系列的研讨会和听证会，邀请了业界专家和学者共同讨论制定标准的可行性和合理性。
经过多次讨论和修改，最终确定了欧盟蜡样芽孢杆菌标准的具体内容和限量要求。
这些标准的制定不仅有助于监督食品生产过程中的卫生安全问题，也对消费者的健康起到了保护作用。
2.2 欧盟蜡样芽孢杆菌标准的内容欧盟蜡样芽孢杆菌标准的内容包括对该细菌的识别和检测方法、食品中蜡样芽孢杆菌的限量要求、食品生产过程中对蜡样芽孢杆菌的控制措施等内容。
针对不同食品种类，这些内容可能会有所不同，但欧盟对蜡样芽孢杆菌的标准主要是为了确保食品的安全和质量。
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V-P反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
明胶液化
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
与类似菌鉴别：
表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 过氧化氢酶 动力 硝酸盐还原 酪蛋白分解 卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧） 甘露醇 木糖 溶血 已知致病菌特性 巨大芽 孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－ － － ＋ ＋/－ － 蜡样芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 产生肠毒素 苏云金芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ 对昆虫致病的 内毒素结晶 蕈状芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋ 假根样生长 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋ 对动物
能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。
二、致病性
食品蜡样芽胞杆菌数量>106/g（mL）时常可导致食物中毒，
导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：100℃30min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。
表1 蜡样芽孢杆菌生化分型
生化试验
型别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
柠檬酸盐利用
＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋
硝酸盐还原
＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
淀粉水解
＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
三、检验方法
1、检验标准； GB 4789.14—2003 2、培养基和试剂 培养基: 肉浸液肉汤培养基 动力-硝酸盐培养基 血琼脂培养基 酪蛋白琼脂培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水 木糖-明胶培养基
甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、 试剂：0.5%碱性复红染色液、革兰氏染色液、3%过氧化氢
报告
菌数测定：
将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上 培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取5个典型菌落 做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。 蜡样芽孢杆菌数=可疑菌落数×证实为阳性菌落数的比例×稀释倍数×10 MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多 粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素 可抑制杂菌的生长。 蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为 粉红色（否则为黄色）。 该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷 脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。
溶液、甲萘胺-乙酸溶液、对氨基苯磺酸-乙酸溶液。
3、检验程序
包括四个步骤： ①菌数测定:涂布甘露醇卵黄多粘 菌素（MYP） 平板计数。 ②分离培养:从MYP上 挑可疑菌 落进行纯培养。 ③证实实验:包括形态观察、培养
检 样 25 g（mL）加225 mL生理盐水
做成10-1~10-5的稀释液 37℃，18 h ~ 24 h
致 病 菌 蜡样芽胞杆菌 检 验
蜡样芽胞杆菌
（一）生物学特性 1、形态与染色
革兰氏阳性大杆菌，宽度在1 μm或1 μm以上，芽孢呈卵圆形，不 突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
2、培养特性
需氧，最适生长温度30~32℃。 在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环，振摇易乳化。 在普通琼脂平板上，菌落灰白色，不透明，边缘不整齐， 表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。 在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状， 有溶血环。 在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌落呈粉红色，具有白色 混浊环（不发酵甘露醇、产生卵磷脂酶）
选择性培养基 （菌数测定） MYP 36℃±1℃ 12 h ~ 20 h
选择性培养基 （分离培养） MYP 36℃±1℃ 12 h ~ 20 h
特性、生化性状和生化分型试验。
④与类似菌的鉴别：主要是与苏 云金芽孢杆菌的鉴别。 ⑤结果报告：报告每g（mL）检样
中所含的蜡样芽孢杆菌数。
生长及菌落观察 染色镜检 生化试验 菌株保存 菌数计算 营养琼脂培养基
注：＋ 90%~100%的菌株阳性；－ 90%~100%的菌株阴性；＋/－ 大多数菌株阳性；－/＋ 大多 数菌株阴性。
★鉴别：
蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要 进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体， 蜡样芽孢杆菌无。
苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体
分离培养和证实试验:
分离培养：从MYP平板上挑可疑菌落到营养琼脂上进行纯培养。 证实试验： （1）形态观察 （2）培养特性 （3）生化性状及生化分型 ①生化性状 本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性； 溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条 件下能发酵葡萄糖。 ②生化分型 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P 反应、明胶液化性状的试验，分成不同的型别。