模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
模式植物拟南芥的去雄和授粉实验
模式植物拟南芥的去雄和授粉实验
授粉是高等植物有性生殖的关键环节，这一过程包括花粉在柱头细胞上黏附、花粉的水合、花粉管的萌发及伸长等，其中涉及很多复杂而有序的调控机制，近年来人们在这一方面的分子机制研究中已取得诸多进展。
本研究鉴定到拟南芥UPS基因的两个不同位点的T-DNA插入突变体，这两个突变体的杂合体自交后代中杂合体植株数与野生型植株数的比例接近1∶1，没有纯合突变体。
分析杂合体植株与野生型植株互交后代基因型发现，该基因的突变导致雄配子体传递率显著下降。
但是亚历山大染色、DAPI染色和体外萌发实验表明杂合体植株的花粉在形态、活性等方面与野生型植株的花粉相比没有明显差异。
但是柱头表面突变的花粉粒容易被表面活性剂NP-40冲洗掉，突变体的花粉粒不能在柱头上萌发并生长出花粉管。
ups突变体的成熟花药中含有两种结构不同的花粉粒，一种与野生型类似，均匀分布大量电子透明的小液泡，约占花粉的62％。
另一种花粉富含许多大液泡，细胞质的电子密度也明显增大，这类花粉粒的线粒体内膜也变地较为模糊。
表明ups突变导致花粉的液泡和线粒体发育出现异常，可能是突变体花粉粒不能在柱头上萌发的原因。
GUS活性分析及原位杂交结果显示UPS在花粉发育过程中表达，11时期花药（花药开裂前，药室退化为两室）中
的花粉UPS表达量最高，但到花粉成熟散出时，却检测不到UPS的表达。
本研究通过研究UPS在花粉与柱头互作中的作用，进一步补充花粉与柱头相互作用中基因的调控网络，使人们进一步了解雄配子体基因在花粉与柱头互作中的作用。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
河南农业科学,2011,40(5):62 66Jour nal of H enan Ag ricultural Sciences拟南芥atcwinv1基因T DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔*,张 莹,王 波(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)摘要:以拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异。
结果表明:拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5 88个百分点;突变体在44d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20 84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62 27个,较野生型降低11 00%;单株果荚种粒数平均45 87粒,较野生型降低21 46%;突变体的单果荚长度平均14 52cm,较野生型降低10 24%;单株果质量平均50 83mg,较野生型降低23 70%。
拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10 44cm,较野生型下降21 03%;主根长平均7 62cm,较野生型下降14 96%;单株莲座叶面积平均3 16cm2,较野生型下降13 90%;单株地上部分鲜质量平均81 81m g,较野生型下降11 11%;单株根鲜质量平均6 21m g,较野生型下降17 64%;单株地上部分干质量平均6 17m g,较野生型下降15 60%;单株根干质量平均0 55mg,较野生型下降6 78%。
拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18 78cm,较野生型增加4 22%;主根长平均16 48cm,较野生型下降5 88%;单株莲座叶面积平均6 80cm2,较野生型下降6 21%;单株地上部分鲜质量平均129 85mg,较野生型下降9 69%;单株根鲜质量平均9 97mg,较野生型下降13 23%;单株地上部分干质量平均9 22mg,较野生型下降4 16%;单株根干质量平均0 70mg,较野生型下降6 67%。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
ＰＣＲ ｄ ｎ ｉｉａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｐｈ ｎ ｔ ｐ ｃ Ｏｂ ｅ ｖ ｔｏ ｆａ ｃ ｉ ｖ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｎ ｅ ｏ ｙ ｉ ｓ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｔｗ ｎ ｌ Ｇｅ ｅ Ｔ— ｎ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔｏ ａ ｕ ａ ｔｏ ｒ ｂ ｄｏ ｉ Ｉ ｓ ｒ ｉ ｎ ｌＭ ｔ ｎ ｆＡ ａ ｉ ｐｓｓ
ｕ ｅ ｏ ｃ ｍ ｐａ ｅ ｐ ａ ｓ ｄ ｔ ｏ ｒ ｌ ｎｔｍｏｒ ｈｏｌ ｉ ａ ｉｆ ｒ ｎｃ ｓ ｉ ｈｅ ｐｅ ｉ ｇｅ ａ ｉ ｅ ｇ ｏｗｔ ｎｄ ｒ ｐｒ ｄｕｃ ｐ ｏｇ ｃ ｌｄ ｆ ｅ ｅ ｅ ｎ ｔ ｒｏｄ ｏｆｖｅ ｔ ｔｖ ｒ ｈ ａ ｅ ｏ — ｔｖ ｏ ｈ． ｉ ｅ ｇｒ ｗｔ Ｔｈｅｒ ｓ ｔ ｈ ｅ ｕｌｓ ｓ ｏｗｅ ｈａ ｏ ｐ ｒ ｄ ｔ ｈｅ ｗｉｄ ｔ ｐｅ ｔ ｒ ｉ ａ ｉ ｎ ｒ ｔ ｆａｔｗｉ ｌ ｄ ｔ ｔｃ ｍ ａ ｅ ｏ ｔ ｌ ｙ ｈｅ ｇｅ ｍ ｎ ｔｏ ａ ｅ ｏ ｃ ｎｖ ａ ｅ ａ ｅ ｙ ｄｅ ｒ ａ ｅ ５ ｖ ｒ ｇ ｌ ｃ ｅ ｓ ｄ ｂｙ ．８８ ｐｅ ｃ ｎｔ ｇｅ ｐ ｎ ｓ； ｏｍｐａ ｅ ｏ ｈ ｗｉｄ ｔ ｅ， ｌｉ ｉ ｅ ｆ ａｒ－ ｒ ｅ ａ ｏｉ ｔ ｃ ｒ ｄ ｔ ｔ ｅ ｌ ｙｐ ｂｏ ｔｎｇ ｔｍ ｏ ｃ
植物DNA提取——拟南芥
【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。
2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。
3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。
4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。
【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。
在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。
研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。
此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。
β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。
经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。
分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。
抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。
Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
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模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。
通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。
关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。
同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。
2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。
2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。
“双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。
具体方法图2所示：首先以基因组DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体（图2-a）；然后再以基因组DNA为模版，由T-DNA片段的特异引物（LB）与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段，以确证所获得突变体为T-DNA插入目的基因的突变体。
此法的不足之处是完成最终鉴定需要进行两轮PCR扩增。
聚合酶链反应是体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出有点。
PCR能在一个试管内将索要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Maker电泳；起到鉴定的作用。
DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。
2.3 实验材料（1）实验材料：拟南芥（2）实验试剂：2*CTAB提取液、液氮、TE、1*TBE缓冲液、TPS、EB、琼脂糖、Loading Buffer、DL2000 marker、bp100 Ladder marker、Lambda DNA/EcoRI marker、10*Taq buffer（MgCl2free）、MgCl2、引物LP、引物BP、引物RP、dNTP、Taq酶（3）实验仪器：离心机、PCR仪、电泳槽、凝胶成像系统2.4 实验步骤（1）DNA提取A.CTAB法①用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀；②65℃水浴30 min，其间轻摇混匀；③向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管；④向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃下30 min ，12000 rpm 离心15 min，弃上清；⑤用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清；⑥将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。
⑦将水浴后的DNA进行PCR或置于-20℃保存B.TPS法①剪取1-2mm2的幼叶，放入0.2ml离心管中；②加入20ulTPS；③用200ul枪尖研磨（冰上）；④在PCR仪上95℃15min.之后立即放入-20 ℃下晾透（约需3.5min)；⑤加入180ul ddH2O混匀。
（2）PCR扩增①配成反应体系，用离心机4000r/min离心10s，并用移液枪反复抽打混匀②将反应体系分装到装有模版DNA的离心管中，用离心机4000r/min离心10s③将离心后的离心管放入PCR仪，设定程序开始PCR（3）电泳鉴定①将50*TAE溶液稀释到1*，为电极缓冲液；②量筒量出40mlTAE加入到锥形瓶中，并称取0.64g琼脂糖加入锥形瓶，用微波炉反复加热使琼脂糖溶于TAE；③待混合液稍微冷却后，将其加入到制作琼脂糖凝胶的模版中，50min后，制得琼脂糖凝胶；④将凝胶放在托板上，一起放入电极槽，1*TAE（电极缓冲液）倒入电极槽，使缓冲液没过凝胶；⑤将扩增好的DNA加入上样缓冲液后，分别用移液枪进行点样，每个孔点20μl；⑥用移液枪取适量的marker点样；⑦用电极槽按5V/cm的电压电泳40-45min；⑧取电泳后的凝胶放入EB中染色15min；⑨将染色后的凝胶放入凝胶成像系统进行观察。
3.结果至今为止，我一共进行了七次实验，其中能看到DNA片段的共有两次，下面将其结果一一呈现：（1）本次试验用的是TPS法制得的DNA，反应体系是：25ul体系H2O 16ul10xTaq buffer （MgCl2free) 2.5ulMgCl2 (25mM) 2ul引物1 (10 uM) 1 ul引物2 (10 uM) 1 uldNTP (各2.5mM) 0.5ul模板DNA(30-50ng/μl) 2ulTaq酶(5U/μl ) 0.2ul这次失败我们怀疑可能是中间需要混匀的几个步骤出现了差错。
（2）本次试验点样较多，其中有CTAB法和TPS法制得的DNA，但仍没有看到片段，体系仍为：25ul体系H2O 16ul10xTaq buffer （MgCl2free) 2.5ulMgCl2 (25mM) 2ul引物1 (10 uM) 1 ul引物2 (10 uM) 1 uldNTP (各2.5mM) 0.5ul模板DNA(30-50ng/μl) 2ulTaq酶(5U/μl ) 0.2ul（3）本次试验由学长进行操作，酶也是学长实验室的，在2楼实验室完成的整个过程。
结果出来了，不过marker选取得不恰当，并且非特异性条带特别多。
反应体系：20ul体系H2O 13ul10xTaq buffer （MgCl2free) 2ulMgCl2 (25mM) 2ul引物1 (10 uM) 0.5 ul引物2 (10 uM) 0.5 uldNTP (各2.5mM) 0.5ul模板DNA(30-50ng/μl) 1ulTaq酶(5U/μl ) 0.5ul（4）本次试验采用的是老师的体系，但是依旧没有结果。
这次点样的时候marker加得也有问题。
反应体系：25ul体系H2O 16ul10xTaq buffer （MgCl2free) 2.5ulMgCl2 (25mM) 2ul引物1 (10 uM) 1 ul引物2 (10 uM) 1 uldNTP (各2.5mM) 0.5ul模板DNA(30-50ng/μl) 2ulTaq酶(5U/μl ) 0.2ul（5）本次试验是采用学长20 ul的体系，在6楼实验室完成的，但是依旧没有出结果，我们怀疑6楼的实验材料的纯度有问题。
反应体系：20ul体系H2O 13ul10xTaq buffer （MgCl2free) 2ulMgCl2 (25mM) 2ul引物1 (10 uM) 0.5 ul引物2 (10 uM) 0.5 uldNTP (各2.5mM) 0.5ul模板DNA(30-50ng/μl) 1ulTaq酶(5U/μl ) 0.5ul（6）本次实验采用的是一种新的20ul的配方，原料除三种引物外都是2楼实验室的，在2楼实验室完成的。
出现的结果相对较好，能够辨认出拟南芥的基因型了。
反应体系：20ul体系H2O 16ul10xTaq buffer （MgCl2free) 2ulMgCl2 (25mM) 2ul引物1 (10 uM) 0.5 ul引物2 (10 uM) 0.5 uldNTP (各2.5mM) 0 .5ul模板DNA(30-50ng/μl) 1.5ulTaq酶(5U/μl ) 1ul（7）本次试验所使用的是和第六次相同的体系，几个不同点是：原料不同、时间不同、PCR 仪不同，但是这次还是没出结果，我又一次怀疑6楼的实验试剂有问题。
4.讨论（1）CTAB法提取DNA，在加入液氮后研磨的时候要快，液氮若快升华完了，则立即补充，不要在无液氮的时候研磨；（2）提取DNA，混匀时不可用力过猛；（3）将DNA加入到反应体系时，最好将同种的反应体系一同配好，然后再分装到不同的管里，这样可以减少误差，在配置总反应体系时，加入的量应该比实际的分数多1-2份，避免在移液过程中损失；（4）配成后可以用移液枪连续抽打混匀；（5）在移液过程中，若有微量液体附着于管壁上，可用离心机离心；（6）移不同成分液体的时候注意更换枪头；（7）在进行PCR时，可先观察其运行一个循环，看是否有异常情况发生；（8）用琼脂糖溶液制作凝胶时，要趁热将溶液倒入模版中，当倾倒的最后，液流变得很细小时停止倾倒，避免凝胶表面不平；（9）移动凝胶时要小心操作，不可使其受到损伤；（10）电泳前要对PCR过的DNA加入Loading Buffer，Loading Buffer有两个作用：①增加DNA的比重，使它的比重大于电极缓冲液，凝胶上的小孔里；②着色，电泳的时候可根据有色条带判断电泳进行的程度；（11）将凝胶加入电极槽中，用电极缓冲液浸没后方可加入DNA与Loading Buffer的混合液，若最后再加入电极缓冲液，会使一部分DNA流失；（12）点样时注意不要让枪头戳破凝胶；（13）若两块凝胶放在同一个电极槽中同时电泳，若点样间隔时间比较长，为避免DNA扩散，可将先点样好的凝胶进行轻微地电泳，当DNA条带从小孔中跑进凝胶时，DNA就不会扩散了，可以继续另一块的点样；（14）电泳时要让跑得快的DNA条带跑到凝胶的2/3处，可根据电泳进行的程度控制时间；（15）制作凝胶时要让琼脂糖溶液在模版中完全冷却，不可操之过急；（16）EB是强致癌物质，进行EB染色时，带上手套，注意脱去手套时不要让EB沾到手上；（17）用凝胶成像系统对凝胶进行拍照时，可以先在紫外灯下看一下DNA条带，由于相机的设置参数不同，可能会造成误差。