第二章 预处理及固液分离技术

2.3.2
沉降系数（S)
2
ρ 1 d p ( s ρ L ) Vs = rω 2 18 μ L
vs
dr = dt
=
Srω
2
ρ 1 d p ( s ρ L ) 2 Vs = rω S＝ 18 μ L
2
沉降系数 S ： 是溶剂物性的函数， 是溶质颗粒浓度的函数（成反比）， 是溶质相对分子量的函数（成正比）
因菌体细胞体积小，沉降速度很慢，不适于应用。
2.3 离心沉降
离心沉降是科研与生产实践最广泛使用的非均相分离 手段。
适用于菌体或细胞的回收或除去，
用于血球、细胞器、病毒及蛋白质分离， 应用于液液相分离。 2.3.1离心沉降速度 重力g作用下的沉降 速度
Vg =
d p ( s ρ L ) g ρ
2
18μ l
沉降层/细胞核（4－6μm)
离心 细胞破 碎液 600g,10min
上清液 (细胞膜碎片、线粒体、溶菌
体、核糖体、水溶性物质
离心 (10000g,10min) 沉降层
（细胞膜碎片、线 粒体、溶菌酶）
上清液
（核糖体、水溶性物质）
离心（100000g，3h) 沉降层（核糖体） 上清液(水溶性物质）
细胞破碎液的差速离心分离
第二章 预处理及固 液分离技术
2012.02
主要内容
预处理的本质（固-液分离） 发酵液的相对纯化方法 絮凝的基本原理和影响因素 细胞破碎的方法 影响离心分离的因素、方法及设备
发酵液的预处理
由于

目的产品在发酵液中浓度很低
与许多杂质（溶解的和悬浮的）夹在一起， 发酵液属于非牛顿型流体 需进行预处理

三、细胞破碎技术
机械法和非机械法 机械法
机械法主要是利用高压、研磨或超声波 等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎 目的。 包括高压匀浆法、珠磨法和超声破碎法。
高压匀浆器 影响匀浆破碎的主要 因素是压力、温度和 通过匀浆器阀的次数。 高压匀浆法的适用范 围较广，在微生物细 胞和植物细胞的大规 模处理中常采用。


超声波振荡过程中 遇到的最大问题就 是产生的热量不容 易驱散，所以影响 了它在大规模工业 上的应用，但在实 验室和小规模生产 中是一种很好的方 法。
非机械法
非机械方法很多，包括酶解、渗透压 冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等。 酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上 特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以 在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用 自溶作用。 酶解法的优点是发生酶解的条件温和、 能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、 细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水 解价格高，故小规模应用较广。
加热能使液体粘度降低，过滤速度加快。
该方法只适合于对热较稳定的生化物质，加 热的温度和时间须严加选择。
调pH



改变发酵液的胶体状态 使产物转入液相 使杂质（蛋白、多糖、Ca2+等）发生沉淀。
一般用草酸或无机酸、碱来调节。 通常加热和调pH协同作用。 例 链霉素生产发酵液预处理时，采用调pH＝3.0 左右，加热至70℃，维持半小时以凝固蛋白质， 这样可使过滤速度增大10～100倍，滤液粘度 降低为原先的1/6。
Q=VgΣ Σ：具有面积的单位， 称为离心沉降面积， 是离心机结构和操作 条件的函数。 L:离心管长 r2:离心机转筒内径 ω：旋转角速度＝2πN N：离心机转数（s-1)
2π L r2 ω Σ = g
2
2
2）碟片式离心机
处理能力Q=VgΣ
Σ＝ 2πn(r13-r23)ω2
r1、r2分别为分离板的 外径和内径，n为分离 板数， φ为分离板与旋 转轴的夹角.
2.3.3 离心沉降溶质完全沉淀所需的时间 ln(R2/R1) t= Sω2 R1、R2：旋转轴中心到样品液表面 和离心管底部的垂直距离 ω旋转角速度＝2πN N：离心机转数（s-1) 2.3.4 分离因数 Z=4π2N2r/g （r: 粒子的离心半径）
是离心力与重力的比值，
是衡量离心程度的参数
（差速区带离心和平衡区带离心） 2.3.5 离心分离方法（差速离心及区带离心） （1）差速离心分离－生化工业中最常用分离方法 （目标产物和其它组分的 性质及相互作用等） 实际物系的特点、分离目的、分离程度 选择适当的操作条件（离心转数和时间） 使料液的不同组分得到分级分离
破碎技术研究的方向
(1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合

第五节 离心技术
离心分离方法
（1）差速离心分离－生化工业中最常用分离方法
（目标产物和其它组分的 性质及相互作用等） 实际物系的特点、分离目的、分离程度 选择适当的操作条件（离心转数和时间） 使料液的不同组分得到分级分离
沉降层/细胞核（4－6μm)
离心 细胞破 碎液 600g,10min
上清液 (细胞膜碎片、线粒体、溶菌
体、核糖体、水溶性物质
离心 (10000g,10min) 沉降层
（细胞膜碎片、线 粒体、溶菌酶）
上清液
（核糖体、水溶性物质）
离心（100000g，3h) 沉降层（核糖体） 上清液(水溶性物质） 细胞破碎液的差速离心分离
反应剂
加入某些反应剂，某些物质或杂 质能转为助滤剂，可消除这些物质
对过滤的影响，从而提高速率。
正确选择能提高3-10倍速率
助滤剂
助滤剂是一种具有特殊性能的细粉 或纤维，它能使某些难于过滤的物料 变得容易过滤。 硅藻土和珍珠岩是两种最常用的助 滤剂。硅藻土是几百年前的水生植物 沉淀下来的遗骸，珍珠岩是处理过的 膨胀火山岩。
高速珠磨机（high spced bead mill） 研磨是常用的一种方 法，它将细胞悬浮液 与玻璃小珠、石英砂 或氧化铝等研磨剂一 起快速搅拌，使细胞 获得破碎。 在工业规模的破碎中 常采用高速珠磨机。

超声波破碎器 超声波处理细胞悬浮液时， 破碎作用受许多因素的影 响，通常声强和振幅影响 很大，但强度太高易使蛋 白质变性，频率的变化影 响不明显：此外介质的离 子强度、pH值、菌体的种 类和浓度也有很大的影响。
间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体 体系不稳定的现象。
通常发酵液中细胞或菌体带负电荷，由于静 电引力的作用将溶液中带相反电性的粒子（即 正离子）吸附在周围，在界面上形成了双电层。 反离子化合价越高，即凝聚能力越强。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+>Fe3+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。 常用的凝聚剂有：Al2(S04)3 · 20(明矾)； 18H AlCl3· 20； FeCl3；ZnS04；MgC03等 6H
二、去除杂质的具体方法
1、无机离子－利用沉淀作用
钙离子：加草酸或磷酸盐 镁离子：磷酸盐 铁离子：加黄血盐，生成普鲁士蓝沉淀 2、可溶性蛋白质 发酵液的预处理主要是如何使可溶性 蛋白质变性沉淀除去。
蛋白质的性质和变性机理
1）沉淀法：酸性溶液与碱性溶液
2）变性法：加热、调pH、酒精、丙酮、表面活性 剂 3）吸附法：有色物质 常用的是离子交换剂、离子交换纤维、活性碳等 材料的吸附法。
3gtan φ
离心分离设备
大容量冷冻离心机
细胞与发酵液分离的方法（5种） 重力沉降、 离心分离、 过滤 双水相萃取
泡沫分离法
2.2重力沉降 【自学】
重力沉降设备体积庞大，分离效率低。 具有设备简单，制造容易，能耗低等优点，在 食品、发酵，特别是环境工程中得到应用。 菌体或动植物细胞的重力沉降虽然简单易行，
如：强碱性阴离子交换剂用于酪蛋白酶或果胶酶的脱色。 阴离子交换树脂用于谷氨酸发酵液脱色。
三、凝聚和絮凝
凝聚与絮凝在预处理中常用于细胞、菌体（胞外
产物）、细胞碎片（胞内产物）以及蛋白质等胶 体粒子的去除。 与热处理和加无机电解质相比，作用条件温和， 实验剂量小。
1）凝聚作用是指在某些电解质作用下，由于胶粒之
dP:粒径， ρS:颗粒密度， ρL：液体密度， μL：液体粘度
离心力
Fc=r •ω2
离心沉降速度
ρ 1 d p ( s ρ L ) 2 Vs = rω 18 μ
2
旋转角速度ω=2πN
vs =
2 d p ( s ρ L ) N 2 r π ρ
2 2
9 L μ
r: 粒子的离心半径，ω：旋转角速 度，N：离心机转速（s-1)
2）絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂存在下， 基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过 程。 絮凝剂必须具有长链线状的结构，易溶 于水，在长的链节上含有相当多的活性功能 团。 絮凝剂的功能团强烈地吸附在胶粒的表 面上。一个高分子聚合物的许多功能基团分 别吸附在不同颗粒的表面上，因而产生架桥 联接。
絮凝剂包括各种天然聚合物和人工合成聚合物。 天然絮凝剂：多糖、海藻酸钠、明胶和骨胶等。 无毒、 使用安全、适于食品或医药。 人工合成的絮凝剂：聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类 物和聚丙烯酸类聚合物等。
分别汲取不同的区带
得到纯ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的各组分
平衡区带离心
平衡区带离心的密度梯度比差速离心的密度梯度大。 离心的结果 料液中高分子物质在与自身密度相等的溶剂密度处形 成稳定的区带。 区带中的高分子物质浓度以该密度处浓度为中心，呈 高斯分布。
（3）等密度离心法

等密度离心的有效 分离仅取决于粒子 的密度差，与粒子 的大小和形状无关， 但是此二者决定着 达到平衡的速度、 时间和区带宽度。
预处理的目的
改变发酵液的物理性质，改善流体性能，提 高过滤速率。 使目的产物转相便于后处理（多数是液相）。 去除发酵液中的部分杂质，便于后续操作。
（在合适的培养基pH、温度和通气搅拌 或经厌氧条件下进行生长并合成生物活 性物质）
（包括菌体、胞 外代谢产物或胞 内酶或核酸等）
通过微生物发酵或动植物培养得到的原料液应 首先将其中的菌体或细胞与培养液分离。
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌：肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：聚合物的网状结构、几丁质、纤 维素的纤维状结构 植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度

二、细胞破碎效果的检查
直接测定法 测定破碎前后的细胞数量 目的产物测定法 测定破碎液中目的产物的释放量（含量、活 性） 测定导电率 导电率随着破碎率的增加而呈线性增加
（2）区带离心－生化研究的重要分离手段
（差速区带离心和平衡区带离心）
在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖）调配好
密度梯度（从大到小加入）
在密度梯度之上加待处理的料液 然后进行离心操作
区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子的 分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。
差速区带离心:
密度梯度最大的密度<待分离的目标产物密度 在离心操作中 料液中各个组分在密度梯度中以不同的速度沉降 据沉降系数差别形成各自的区带 经过一定时间
某些絮凝剂可能具有一定的毒性，在食品和医药 工业的使用中应考虑最终能否从产品中除去。
第四节 细胞破碎
定义: 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程 度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产 物最大程度地释放到液相中，破碎后的细 胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采 用不同的分离手段进一步纯化.
一、细胞壁的组成和结构
渗透压冲击法 冻融法 干燥法 化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或 抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性 剂和有机溶剂等化学试剂。

选择破碎方法的依据
(1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4)破碎程度 适宜的操作条件应从高的产物释放率、 低的能耗和便于后步提取这三方面进行 权衡
（2）区带离心－生化研究的重要分离手段 （差速区带离心和平衡区带离心）
离心分离设备及处理能力
离心机是生物相关实验室及生物制品生产企业广泛 使用的分离设备。

实验室用离心机以离心管式转子离心机为主，为 间歇式。（一般为冷冻离心机） 工业用离心设备一般要求有较大的处理能力并连 续操作。
常用的有管式和蝶式两大类。

1） 管式离心机
离心机处理能力（一定时间内处理多少料液量）
如果目标产物为胞外代谢物则直接对培养 液进行分离纯化；
如果目标产物为胞内代谢产物，要对细胞 进行处理，释放目标产物，然后除去细胞 碎片，再进行目标物质的纯化。
一、预处理特性的改变方法
取决于可分离物质的性质，主要考虑目的物质的 分子大小、热稳定性、pH的适应性。
加热：最简单最经济的预处理方法（常用）