双歧杆菌的分离培养及鉴定
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1 范围本标准规定了食品用双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定及计数方法。
本标准适用于食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。
本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定；以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数，双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 天平：感量0.1 g。
2.4 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.5 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸头。
2.6 无菌培养皿：直径90 mm。
3 培养基和试剂3.1 双歧杆菌培养基：见附录A.1。
3.2 PYG培养基：见附录A.2。
3.3 甲醇：分析纯。
3.4 三氯甲烷：分析纯。
3.5 冰乙酸：分析纯。
3.6 乳酸：分析纯。
3.7 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.8 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
4 检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。
图1 双歧杆菌的检验程序5 操作步骤5.1无菌要求：全部操作均应遵循无菌操作程序。
5.2 食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数5.2.1 鉴定5.2.1.1 接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。
真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。
平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
5.2.1.2 涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【摘要】为丰富发酵剂及益生菌菌种资源,从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品,在传统细菌分离方法的基础上,通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)改良基础培养基,快速有效地分离获得双歧杆菌.结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种.结果共分离获得6株双歧杆菌,其中3株动物双歧杆菌,2株青春双歧杆菌,1株短双歧杆菌.试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳.%In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources, faeces collected from sev-en infants(Alashan, Inner Mongolia) were investigated. On the basis of traditional bacterial separation method, Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium, to separate the bifidobacterium effectively. Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacteri-um. In total, six strains of bifidobacterium were obtained from infacts' faeces, among which three strains were Bifidobacterium lactis, two strains were Bifidobacterium adolescentis, and one strain was Bifidobacterium breve, and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)023【总页数】6页(P171-176)【关键词】双歧杆菌;全自动微生物分析系统;API20A试剂条;冷冻保藏【作者】乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【作者单位】内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500【正文语种】中文双歧杆菌是存在于人体肠道中的益生菌，在长期进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系，具有改善肠道健康、增强免疫功能、防治便秘腹泻、缓解乳糖不耐、促进营养物质吸收、降三高和抗肿瘤等多种保健功能[1-4]。
双歧杆菌的分离与鉴定_吴拥军
作者单位:贵州农学院食品科学系 贵阳 550025 中国收稿日期:1997-01-03双歧杆菌的分离与鉴定吴拥军 王嘉福 尹峻峰摘 要 研究了适宜的双歧杆菌分离方法,从婴儿、成人粪便中分离到36株疑似双歧杆菌,经过属和种的系统生化鉴定,确认为青春双歧杆菌(B if idobacterium adoles -centis )20株和长双歧杆菌(Bif idobacterium longum )6株。
关键词 双歧杆菌 分离 鉴定 双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一种重要的微生物,它有益于健康的原因被逐渐弄清。
它以生成醋酸为主,同时生成乳酸和少量的甲酸,在肠道中造成低pH 环境,抑制肠道中有害菌和致病菌的生长[1]。
双歧杆菌不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,其代谢产物可抑制肠道中的硝酸盐还原细菌,可消除或显著减少亚硝酸盐致癌物质对人体的危害,并能合成多种维生素,促使酪蛋白消化,调节菌群失调,激活吞噬细胞活性,消除自由基、过氧化脂质及腐败菌产生的吲哚胺、氨、硫化氢有害物质[6]。
双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求很高,对低pH 的抵抗能力极差,活性保持比较困难。
目前文献报道的方法[2][3][6]大多需要较高的实验条件或重复性差。
因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 分离样品采自贵阳地区婴儿、成人的粪便。
1.1.2 培养基分离培养基(%):蛋白胨2.0,酵母浸膏粉0.25,葡萄糖0.5,磷酸氢二钠0.25,氯化钠0.5,硫代乙醇酸钠0.1,L -半胱氨酸0.1,天冬氨酸0.01,重铬酸钾0.2,琼脂 1.5,牛肉汤50ml,肝汤50ml 。
调至p H7.5,0.7×105Pa 灭菌20min,冷至55℃加入5%～6%的无菌兔血或羊血制成培养皿平板。
增殖、纯化培养基:参照 1.2.1(不加兔血或羊血)。
糖发酵培养基(%):氯化钠0.5,蛋白胨 1.0,酵母浸膏0.25,硫代醇酸钠0.1,20%糖溶液 5.0m l,调节pH7.5,1kg /cm 2,30min 。
双歧杆菌分离培养鉴定
1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36°C±1°C。
2.2气相色谱仪配FID检测器。
2.3冰箱：2C〜5C。
2.4天平：感量0.1g。
2.5无菌试管：18mm X180mm、15mm X100mm。
2.6无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200口L〜1000口L)及配套吸头。
2.7无菌锥形瓶：500mL、250mL。
2.8显微镜2培养基和试剂3.1BS培养基3.2PYG培养基3.3TPY培养基3.4NPNL培养基3.5X-GAL培养基3.6氟化钠：化学纯。
3.7碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。
3.8果糖-6-磷酸盐：化学纯。
3.9盐酸羟胺(HydroxyLamine-HCl)：化学纯。
3.10三氯乙酸(TCA):化学纯。
3.11三氯化铁(FeC13・6H2O)：化学纯。
3.12甲醇:分析纯。
3.13三氯甲烷：分析纯。
3.14硫酸：分析纯。
3.15冰乙酸：分析纯。
3.16乳酸：分析纯。
3.17乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1mol/L。
3.18乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3.19乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中,加水至刻度，标定，标定方法见附录B.2,此溶液浓度约为1mol/L。
3.20乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取lg双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。
婴儿双歧杆菌BI-G201的分离与鉴定
婴儿双歧杆菌BI-G201的分离与鉴定冯仕云;龚萍;蒋德意;韩迪【摘要】从由健康母乳喂养的婴儿肠道内容物中取得的5份样品中,利用选择性培养基和需氧条件分离筛选得到6株双歧杆菌。
经菌落形态特征、生理生化特性及糖发酵试验,6株乳酸菌的鉴定结果为:2株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),2株乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis),2株婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)。
再经过16S r RNA基因序列测序分析对比,确认分别为长双歧杆菌、乳双歧杆菌和婴儿双歧杆菌BI-G201。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2016(000)006【总页数】4页(P41-43,46)【关键词】婴儿肠道;双歧杆菌;分离;鉴定;16S rRNA基因序列测序【作者】冯仕云;龚萍;蒋德意;韩迪【作者单位】润盈生物工程(上海)有限公司【正文语种】中文【中图分类】R371899年，法国巴黎儿童医院的蒂赛（Henry Tissier），从婴儿粪便中分离了第1株双歧杆菌（当时称为分叉杆菌）[1]，并且他发现双岐杆菌与婴儿患腹泻的频率及营养都有关系。
双歧杆菌是人体肠道菌群中的重要成员，有着至关重要的作用，维持着肠道菌群的微生态平衡，有调节肠胃、增强免疫力、抗菌、防肿瘤甚至影响人体认知等多种重要的生理功能[2-6]。
在人体肠道中，随着年龄的增长，有益菌的种类与数量明显有所下降。
所以，在母乳喂养的婴儿体内是最多的，尤其双歧杆菌在母乳喂养儿肠道内大量存在，对婴幼儿有许多生理功能方面的好处，其中婴儿双歧杆菌就是其中一种菌种。
近年来，随着人们对健康意识的逐渐提升，双歧杆菌也被广泛地应用于医药、保健品或食品中[7]。
该文从婴儿肠道内容物中分离出婴儿双歧杆菌，对其进行生化研究及鉴定，从而为以后长期的研究和应用打下良好的种质资源基础。
1.1 样品来源采集由健康母乳喂养的婴儿的肠道内容物样品5份。
双歧杆菌的分类鉴定
双歧杆菌的分类鉴定双歧杆菌是一种常见的乳酸细菌，具有很多种类，其分类鉴定过程是微生物学中一个重要的部分。
下面将按照流程分步骤阐述双歧杆菌的分类鉴定。
第一步：样本收集首先，需要从目标样品中收集双歧杆菌。
样品可以来自不同的来源，包括人体肠道、动物肠道、泥土、水样等。
在收集样品时，要严格按照规定的方法进行，避免污染和杂质的干扰。
第二步：预处理样品收集到的样品可能包含大量杂质和其他微生物。
因此，在进行分类鉴定之前，必须对样品进行预处理。
处理过程中，需要对样品进行消毒、滤液、大肠杆菌的去除等。
只有经过预处理后的样品才能进行后续的分类鉴定工作。
第三步：菌落分离通过培养，将目标微生物分离出单个菌落。
在分离时要保证菌落的纯度，尽可能地去除其他细菌的干扰。
为了提高鉴定的准确性，建议在分离时同时留取多个单克隆，每一个都应该经过相同的操作来验证。
第四步：生理生化特性判定生理生化特性是鉴定双歧杆菌的关键部分。
常见的生理生化特性包括菌种的形态特征、代谢途径、对培养基的需求等。
对菌落气味、颜色和形态等方面进行观察，测量它们的生长特性。
这一步是识别双歧杆菌是否出现新物种的关键所在。
第五步：分子生物学检测为了提高鉴定的准确性，建议在第四步生理生化特性判定后进行分子生物学检测。
这包括测序、PCR等操作。
通过这些操作可进一步鉴定目标细菌的种类、品种。
在这一步中借助了现代的科研技术，为双歧杆菌的分类鉴定提供了非常有力的支持和助力。
综上所述，双歧杆菌的分类鉴定涉及许多步骤，包括样品的收集和预处理、分离菌落、生理生化特性分析和分子生物学检测等。
这一过程需要技术经验和实验操作配合，具有较高的技术难度和风险性。
只有通过严格流程的操作和准确安排，才能确保双歧杆菌的分类鉴定具有科学性、合法性和完整性。
双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
固定维生素、矿物质、L-半胱氨酸、吐温-80的用量，采用正交实验设计(L16(43))优化氮源（A）、碳源 （B）和酵母浸出粉（C）的用量，因素水平见表1。
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
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厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH
8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。
目前，双歧杆菌鉴定的方法有很多种。
近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD 技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。
一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。
实验用具
高纯氮气厌氧管注射器培养箱冰块水浴锅镊子记号笔 MRS培养基细菌生化微量鉴定管酒精棉球瓷盘振荡器铜柱除氧系统定量加样器
恒温水浴载玻片显微镜恒温培养箱超声波破碎仪滤纸层析缸酒精灯封口膜厌氧罐等。
实验方法与步骤
1铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
2预还原培养基及稀释液的制备
制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。
此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
3分离
（1）编号
取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。
（2）稀释
在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。
用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。
依此进行10倍系列稀释，至10-7，制成不同样品稀释液。
通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数。
（3）滚管分离
1）滚管
将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0
.1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。
2）分离
生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。
如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。
待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。
然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。
同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。
将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。
37℃培养。
培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。