第8章 药物转录组学

三者比较
• 芯片无法同时大量地分析组织或细胞内基 因组表达的状况，而且由于芯片技术需要 准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的、 表达丰度不高的、可能是很重要的调节基 因。SAGE是近年来发展的以测序为基础的 分析特定组织或细胞类型中基因群体表达 状态的一项技术。其显著特点是快速高效 地、接近完整地获得基因组的表达信息。 SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表 达情况，在疾病组织、癌细胞等差异表达 谱的研究中，SAGE可以帮助获得完整转录 组学图谱、发现新的基因及其功能、作用 机制和通路等信息。
3.大规模平行信号测序系统
• 大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)是 以基因测序为基础的新技术，其方法学基础 是一个标签序列（10-20bp）含有能够特异 识别转录子的信息，标签序列与长的连续分 子连接在一起，便于克隆与序列分析。通过 定量测定可以提供相应转录子的表达水平， 也就是将mRNA的一端测出一个包含10-20 个碱基的标签序列，每一个标签序列在样品 中的频率（拷贝数）就代表了与该标签相应 的基因表达水平。
三、转录组学
（一）概念
• 转录组学（transcriptomics），是一门在 整体水平上研究细胞中基因转录的情况及 转录调控规律的学科。简而言之，转录组 学是从RNA水平研究基因表达的情况。
（二）转录组学研cDNA芯片（GeneChip， microarray）
• (6) 洗脱除去寡核苷酸接头,经过Bbv1 酶切 后的cDNA 模板,进入下一轮分析。重复 (3) ～ (5) 的步骤4～5 次后,分析所得到的 16～20 张荧光显微照片,就可以读出微球体 阵列中每一个微球体上长度为16～20bp 的 cDNA 模板序列。
应用
• MPSS 一方面可提供某一cDNA 在体内特 定发育阶段的拷贝数,另一方面还可测定出 相应cDNA16～20bp 的序列,所以这就为 在转录水平上进行基因表达分析提供了强 有力的定性和定量手段,很明显这一技术首 先可以应用于不同丰度基因的差异表达分 析,制作基因转录图谱
通常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以 称为DNA芯片 。
生物芯片包括：
DNA芯片：寡核苷酸和cDNA 蛋白质芯片 其它芯片
• 按用途分
– 表达谱芯片 – 诊断芯片 – 指纹图谱芯片 – 测序芯片 – 毒理芯片
• 芯片实验室是生物芯片技术发展的 最终目标
制备靶片 段
实验组
制备固相探 针
（组织，细胞）
• (4) 分别加入能产生红黄蓝绿杂交信号的四 套荧光探针,进行杂交, 每次杂交完毕用洗脱 液清洗微球体阵列,除去上一轮杂交的荧光 探针。用显微拍照的方法记录荧光信号,并 将四种信号的图像输入计算机储存。 • (5) 用II 型限制性酶Bbv1 进一步消化 cDNA模板,Bbv1 能在距识别位点约13 个 碱基的位置切割cDNA 双链,并在cDNA 模 板上产生下4 个碱基末端。
原位合成(In Situ Synthesis)
Light directed oligonucleotide synthesis.
A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is r e p e a t e d , a c t i va t i n g different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each sNA , mRNA
扩增
PCR, RT—PCR，固相PCR
标记
荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性 标记
分子杂交
样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 1. 杂交时间短，30分钟内完成 2. 可同时平行检测许多基因序列
影响杂交反应的因素：
• (2) 用DpnII 酶切处理微球体上的cDNA 模 板,形成粘性末端。 • (3) 用含有II 型限制性内切酶Bbv1 识别位 点的不同寡核苷酸接头与连接在微球体上 的cDNA 模板相连接,另外每一种接头的3’ 端还带有一个荧光标记,可与荧光探针杂交, 产生荧光信号,该信号可以反映出接头5’端 与模板cDNA 杂交的不同位置上的碱基信 息,从而获取模板cDNA 的序列信息。
二、转录组与基因组的关系
1.转录组来自于基因组,量小得多但重要（人类 基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有 3万个基因转录成mRNA分子，转录后的 mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转 录组的40%左右）。 2.转录组的定义中包含了时间和空间的限定。 同一细胞在不同的生长时期及生长环境下， 其基因表达情况是不完全相同的。
2.基因表达系列分析
• 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是通过快速 和详细分析成千上万个EST（express sequenced tags）来寻找出表达丰富度 不同的SAGE标签序列，从而比较完整地 获得基因组的表达信息。 • SAGE能够快速、全范围提取生物体基因 表达信息，对已知基因进行量化分析。 SAGE也能应用于寻找新基因。
第八章
药物转录组学
第一节
转录组学概述
• 2000年是基因组之年，完成了人类基因 组的工作框架图，完成了一系列模式生 物和微生物的基因组序列分析。
任务与目标
基因的功能是什么？ 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程？ 基因表达的调控、基因与基因产物之间的相互 作用、以及相同的基因在不同的细胞内或者疾 病和治疗状态下表达水平？
• SAGE用于定量地、平行地分析大量的转录 本。若要知道一种组织，器官或细胞的基因 表达谱，首先从组织细胞里分离出短的诊断 性Tags ，归类并克隆。测定数千个克隆的 DNA序列就可以了解代表这种组织、器官或 细胞的功能的基因表达谱。所以SAGE提供 了一种广泛应用的工具，定量地分析比较各 种正常组织细胞，各种发育状态和各种病理 状态下的基因表达谱。
SA dT为引物将mRNA反转 录合成双链cDNA，经锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）酶（如Nla Ⅲ、Sau3AⅠ等） 切后收集cDNA的3’端部分。
anchor 锚，靠山 synthesis 综合物
• MPSS是对SAGE的改进，它能在短时间内 检测细胞或组织内全部基因的表达情况， 是功能基因组研究的有效工具。因其需要 配套的软硬件较为昂贵，目前国内外的相 关应用报道不多。MPSS技术对于致病基因 的识别、揭示基因在疾病中的作用、分析 药物的药效等都非常有价值，该技术的发 展将在基因组功能方面及其相关领域研究 中发挥巨大的作用。
对照组 （组织，细胞）
提取mRNA
Cy5标记
提取mRNA
Cy3标记
杂交
结果观察，信息分析
基因芯片的特点：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 操作简单 自动化程度高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本较低
DNA芯片技术步骤
芯片制备
实性材料：硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨 基活性基团。 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜 通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸
技术方法
• (1) 首先将cDNA 模板体外“克隆”到直径 5μm的微球体上。“克隆”的方法主要是利 用人工设计长度不同的两类互补寡核苷酸,分 别与cDNA 模板和微球体连接之后,再将 cDNA 模板与微球体连接起来。为了能装载 下细胞内所有的cDNA 模板(若以3～4 ×104 个基因计算) ,寡核苷酸的数量至少应该要比 模板的量多100 倍以上。
盐浓度、温度、反应时间、DNA二级 结构
④检测分析
1. 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 2. 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交 点的信号 3. 软件进行进行图象分析和数据处理
基因芯片工作流程示意图
目录
DNA芯片技术的应用
DNA测序；杂交测序（SBH） 基因表达谱分析： 基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因 功能分析 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及 在RNA水平上检测致病基因的表达 药物研究与开发：
zyme酶，病菌 enzyme酶
• ②将收集的3’端cDNA等分为两部分，分 别同接头A、B相连接。每一种接头的结构 都由PCR扩增引物A或B的序列、标签酶识 别位点和锚定酶识别位点三部分组成。 • 标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种 IIS类限制性内切酶，如BsmF I等，它在距 识别位点下游约20bp的位置切割DNA双链。
一、转录组（transcriptome）
广义是指某一生理条件下某个物种或者特定 细胞类型产生的所有RNA的集合，包括信 使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码 RNA；狭义上指所有mRNA的集合。 • 以DNA为模板合成RNA的转录过程是基因 表达的第一步，也是基因表达调控的关键 环节。所谓基因表达，是指基因携带的遗 传信息转变为可辨别的表得到的标签数据进行分析处理。 在所测得序列中的每个双标签体之间由锚定 酶序列相间隔，每一标签序列是否出现以及 出现的频率将代表基因是否表 达以及表达的 水平。一般一个测序反应的结果可得到约20 个双标签体，亦即包含了约40个转录本的信 息。
1.基因芯片技术