转录组学及其在药学中的应用

三者比较
• 芯片无法同时大量地分析组织或细胞内基 因组表达的状况，而且由于芯片技术需要 准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的、 表达丰度不高的、可能是很重要的调节基 因。SAGE是近年来发展的以测序为基础的 分析特定组织或细胞类型中基因群体表达 状态的一项技术。其显著特点是快速高效 地、接近完整地获得基因组的表达信息。 SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表 达情况，在疾病组织、癌细胞等差异表达 谱的研究中，SAGE可以帮助获得完整转录 组学图谱、发现新的基因及其功能、作用 机制和通路等信息。
三、转录组学
（一）概念
• 转录组学（transcriptomics），是一门在 整体水平上研究细胞中基因转录的情况及 转录调控规律的学科。简而言之，转录组 学是从RNA水平研究基因表达的情况。
（二）转录组学研杂交：cDNA芯片（GeneChip， microa录
DNA芯片技术的应用
DNA测序；杂交测序（SBH） 基因表达谱分析： 基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因
功能分析 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及
在RNA水平上检测致病基因的表达 药物研究与开发：
2.基因表达系列分析
• 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是通过快速 和详细分析成千上万个EST（express sequenced tags）来寻找出表达丰富度不 同的SAGE标签序列，从而比较完整地获 得基因组的表达信息。
SA dT为引物将mRNA反转录
合成双链cDNA，经锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）酶（如Nla Ⅲ、Sau3AⅠ等） 切后收集cDNA的3’端部分。
anchor 锚，靠山 synthesis 综合物 zyme酶，病菌 enzyme酶
技术方法
• (1) 首先将cDNA 模板体外“克隆”到直径5μm 的微球体上。“克隆”的方法主要是利用人工 设计长度不同的两类互补寡核苷酸,分别与 cDNA 模板和微球体连接之后,再将cDNA 模 板与微球体连接起来。为了能装载下细胞内 所有的cDNA 模板(若以3～4 ×104 个基因计 算) ,寡核苷酸的数量至少应该要比模板的量 多100 倍以上。
• SAGE用于定量地、平行地分析大量的转录 本。若要知道一种组织，器官或细胞的基因 表达谱，首先从组织细胞里分离出短的诊断 性Tags ，归类并克隆。测定数千个克隆的 DNA序列就可以了解代表这种组织、器官或 细胞的功能的基因表达谱。所以SAGE提供 了一种广泛应用的工具，定量地分析比较各 种正常组织细胞，各种发育状态和各种病理 状态下的基因表达谱。
基因芯片制备-杂交反应
• cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规 的分子杂交过程基本相同；
• 用于检测基因表达，较长的杂交时间，高 的严谨性，高的样品浓度和低温度；
• 用于突变检测，因要鉴别出单碱基错配， 需要更高的杂交严谨性和更短的时间。
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样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 1. 杂交时间短，30分钟内完成 2. 可同时平行检测许多基因序列
一、转录组（transcriptome）
广义是指某一生理条件下某个物种或者特定 细胞类型产生的所有RNA的集合，包括信 使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码 RNA；狭义上指所有mRNA的集合。
• 以DNA为模板合成RNA的转录过程是基因 表达的第一步，也是基因表达调控的关键 环节。所谓基因表达，是指基因携带的遗 传信息转变为可辨别的表型的整个过程。
• 按固体支持物不同，基因芯片可分为：薄膜型、玻片型 、微板型、集成电路型、微通道型等；
• 近年基因芯片技术结合微电极技术、微型聚乙烯酰胺凝 胶技术、高速微通道技术制备出了电子芯片（ Electronic biochip）、三维芯片（three-dimensional biochip）、流过式芯片(flow-through biochip)等新型芯 片。
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基因芯片的制备-合成点样
• 点样探针：基因组探针、cDNA探针以及寡核苷酸探针 ；
• 载体表面的活化主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷 偶联试剂，使载体表面带有羟基或者氨基等活性基团。
• 合成点样过程：机械臂将不同探针样品定量(0.25～1.0μl) 点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为 100～150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微 阵列或芯片。
• (2) 用DpnII 酶切处理微球体上的cDNA 模 板,形成粘性末端。
• (3) 用含有II 型限制性内切酶Bbv1 识别位点 的不同寡核苷酸接头与连接在微球体上的 cDNA 模板相连接,另外每一种接头的3’端还 带有一个荧光标记,可与荧光探针杂交,产生 荧光信号,该信号可以反映出接头5’端与模 板cDNA 杂交的不同位置上的碱基信息,从 而获取模板cDNA 的序列信息。
hybridization • Hybridized probes (DNA molecules) are
fluorescently labeled
通常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以 称为DNA芯片 。
生物芯片包括：
DNA芯片：寡核苷酸和cDNA
蛋白质芯片 其它芯片
• 按用途分
– 表达谱芯片 – 诊断芯片 – 指纹图谱芯片 – 测序芯片 – 毒理芯片
• ②将收集的3’端cDNA等分为两部分，分别 同接头A、B相连接。每一种接头的结构都 由PCR扩增引物A或B的序列、标签酶识别 位点和锚定酶识别位点三部分组成。
• 标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种IIS 类限制性内切酶，如BsmF I等，它在距识 别位点下游约20bp的位置切割DNA双链。
• SAGE能够快速、全范围提取生物体基因 表达信息，对已知基因进行量化分析。 SAGE也能应用于寻找新基因。
SAGE的主要依据有两个。
• 第一，一个9～10碱基的短核苷酸序列标签 包含有足够的信息，能够唯一确认一种转 录物。
• 第二，如果能将9碱基的标签集中于一个克 隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸 顺序以连续的数据形式输入计算机中进行 处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行 分析。
互连接成为大片段的连对测序得到的标签数据进行分析处理。
在所测得序列中的每个双标签体之间由锚定 酶序列相间隔，每一标签序列是否出现以及 出现的频率将代表基因是否表 达以及表达的 水平。一般一个测序反应的结果可得到约20 个双标签体，亦即包含了约40个转录本的信 息。
• (6) 洗脱除去寡核苷酸接头,经过Bbv1 酶切 后的cDNA 模板,进入下一轮分析。重复 (3) ～ (5) 的步骤4～5 次后,分析所得到的 16～20 张荧光显微照片,就可以读出微球体 阵列中每一个微球体上长度为16～20bp 的 cDNA 模板序列。
应用
• MPSS 一方面可提供某一cDNA 在体内特 定发育阶段的拷贝数,另一方面还可测定出 相应cDNA16～20bp 的序列,所以这就为在 转录水平上进行基因表达分析提供了强有 力的定性和定量手段,很明显这一技术首先 可以应用于不同丰度基因的差异表达分析, 制作基因转录图谱
• (4) 分别加入能产生红黄蓝绿杂交信号的四 套荧光探针,进行杂交, 每次杂交完毕用洗脱 液清洗微球体阵列,除去上一轮杂交的荧光 探针。用显微拍照的方法记录荧光信号,并 将四种信号的图像输入计算机储存。
• (5) 用II 型限制性酶Bbv1 进一步消化cDNA 模板,Bbv1 能在距识别位点约13 个碱基的 位置切割cDNA 双链,并在cDNA 模板上产 生下4 个碱基末端。
3.大规模平行信号测序系统
• 大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)是 以基因测序为基础的新技术，其方法学基础 是一个标签序列（10-20bp）含有能够特异 识别转录子的信息，标签序列与长的连续分 子连接在一起，便于克隆与序列分析。通过 定量测定可以提供相应转录子的表达水平， 也就是将mRNA的一端测出一个包含10-20 个碱基的标签序列，每一个标签序列在样品 中的频率（拷贝数）就代表了与该标签相应 的基因表达水平。
影响杂交反应的因素：
盐浓度、温度、反应时间、DNA二级 结构
基因芯片制备-结果检测分析
• 检测方法很多，如荧光显影法、质谱法 、化学发光和光导纤维等。
• 检测系统主要由信号产生、信号收集及 传输、信号处理及成像三个部分组成。
1. 2. 3.
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激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号 软件进行进行图象分析和数据处理
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基因芯片的制备-合成点样
• 点样装置的不同分为：打印法合成点样及其喷印法合 成点样；
• 打印法的优点是探针密度较高，1平方厘米通常可打 印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好， 打印针易堵塞。
• 喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。 缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，1平方厘米 通常只可喷印400个探针。
二、转录组与基因组的关系
1.转录组来自于基因组,量小得多但重要（人类 基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有3 万个基因转录成mRNA分子，转录后的 mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转 录组的40%左右）。
2.转录组的定义中包含了时间和空间的限定。 同一细胞在不同的生长时期及生长环境下， 其基因表达情况是不完全相同的。
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样品的处理
• 样品的扩增：在标记和分析前对样品进行 适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度；
• 待测样品的标记 ：多采用荧光标记方法 ，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同 位素检测法。
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样品分离纯化
DNA , mRNA
扩增
PCR, RT—PCR，固相PCR