肌肉活检细胞色素C氧化酶染色方法
细胞色素C的制备
一、Cytc性质
细胞色素在线粒体内膜起电子传递作用，Cytc 在线粒体呼吸链上位于Cytb和细胞色素氧化酶之 间，是呼吸链重要组成部分。
每分子Cytc含有一个血红素和一条多肽链， Cytc中Lys含量较高，pI=10.7，含 Fe0.38%~0.43%，Mt=12000~13000。
Cytc分氧化型和还Байду номын сангаас型两种，氧化型呈深红色， 还原型呈桃红色。Cytc吸收峰：
氧化型 408nm，530nm 还原型 415nm，520nm，550nm。 在550nm，摩尔吸收系数 K1氧化型（0.9 ×104/mol）/cm K2还原型（2.77×104/mol）/cm
二、实验设计及流程
四、各项指标测定（第三天） （4课时）
1、 Cytc产量
Y1 (mg)＝E1(A)／K1×Mwt(12400)×3×V(最后量取离心 后）×1
Y2 (mg)＝E2(A)／K2×Mwt(12400)×3×V (最后量取离心 后）×1
Cytc产量(mg) ＝(Y1+ Y2)/2
产率=产量（mg）/心肌（kg）＞50（技术指标）
2、测定产品的分光光度吸收值
从400-580nm每隔10nm扫描一次，绘出吸收曲线（波长光密度值)
3、蛋白质量（mg）=（1.45×A280-0.740×A260）×V毫升 （若稀释需乘倍数）
纯度=产量/蛋白质量
蛋白浓度mg/mL= 1.45×A280-0.740×A260 ＞0.5
匀浆抽提→盐析除肌红蛋白、血红蛋白→选择性 变性沉淀→复性透析→测定产量、产率、纯度、 光吸收值
三、实验方法
1、提取除杂（4课时） 猪心（150g左右）→加入0.145mol/L TCA（150mL左右
细胞色素c定位方法
细胞色素c定位方法细胞色素c是一种存在于细胞质中的蛋白质，它在细胞的呼吸链中起着重要的作用。
因此，准确地确定细胞色素c的定位对于研究细胞呼吸和能量代谢具有重要意义。
在过去的几十年里，科学家们利用各种方法研究了细胞色素c的定位。
一种常用的细胞色素c定位方法是细胞色素c氧化还原电位法。
这种方法通过测量细胞色素c氧化还原过程中的电位变化来确定细胞色素c的定位。
这种方法可以直接在细胞质中进行，非常方便。
科学家们通过添加氧化还原剂和还原剂来改变细胞色素c的氧化还原状态，并使用电极来监测氧化还原过程中的电位变化。
通过分析电位变化的曲线，科学家们可以推断细胞色素c的定位。
然而，这种方法在测量时需要注意操作的细节，以确保结果的准确性。
另一种常用的细胞色素c定位方法是细胞色素c免疫染色法。
这种方法利用细胞色素c的免疫原性，通过添加特异性抗体来检测细胞色素c在细胞中的定位。
首先，科学家们需要制备细胞色素c的抗体。
他们可以通过注入细胞色素c蛋白质到动物体内或利用重组DNA技术来获得细胞色素c的抗体。
然后，他们可以将抗体标记上荧光物质或酶来增强信号，使细胞色素c在显微镜下更容易观察。
最后，科学家们将抗体添加到细胞样本中，并使用显微镜观察细胞色素c的定位。
除了免疫染色法，还有一种常用的细胞色素c定位方法是荧光蛋白标记法。
这种方法利用基因工程技术，在细胞色素c的氨基酸序列中添加荧光蛋白标记。
当细胞色素c和荧光蛋白合成后，科学家们可以通过观察荧光蛋白的发射信号来确定细胞色素c的定位。
荧光蛋白标记法具有分子水平的精确性，并且可以应用于活细胞观察，在细胞色素c的研究中应用广泛。
总的来说，细胞色素c的定位是细胞生物学和生物化学研究中的一个重要问题。
科学家们通过细胞色素c氧化还原电位法、细胞色素c免疫染色法和荧光蛋白标记法等多种方法对细胞色素c的定位进行研究。
这些方法各有优劣，可以相互补充，在不同情况下选择合适的方法来研究细胞色素c的定位。
细胞色素C过敏试验护理规范
细胞色素C过敏试验
细胞色素C是一种辅酶，在生物氧化过程中起着传递电子的作用，改善缺氧时的细胞呼吸，促进物质代谢，临床多用做能量合剂的配方。
应用时要警惕过敏反应。
为防止过敏反应，在用药前应先作过敏试验。
一、皮试液的配制
取细胞色素C（每支2ml含15mg）0.1ml加等渗盐水至1ml，每ml含 0.75mg 。
二、试验方法
（一）皮内试验取细胞色素C试验液 0.1ml(含0.075mg),作皮内注射，观察20分钟后，判断试验结果。
（二）划痕试验取细胞色素C原液（每ml含2.5mg）1滴，滴于前臂内侧皮肤上作划痕法（以无菌针头透过药液，划刺皮肤两道，长约5mm，其深度以不出血为宜。
即划破皮不出血。
）观察20分钟后判断试验结果。
三、试验结果判断
局部发红，直径大于1cm，有丘疹者阳性。
鸡细胞色素C氧化酶COX酶联免疫分析ELISA
鸡细胞色素C氧化酶(COX)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡组织样本中细胞色素C氧化酶(COX)的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡细胞色素C氧化酶(COX)的水平。
用纯化的鸡细胞色素C氧化酶(COX)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入细胞色素C氧化酶(COX)再与HRP标记的细胞色素C氧化酶(COX)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的细胞色素C氧化酶(COX)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡细胞色素C氧化酶(COX)活性浓度。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
实训2 细胞色素C粗品的制备及含量测定
图2-1 细胞色素c 分子结构式 实训2 细胞色素C 粗品的制备及含量测定【背景介绍】细胞色素（Cytochrome ）是一类含铁卟啉辅基的电子传递蛋白，在线粒体内膜上起传递电子的作用。
线粒体中的细胞色素大部分与内膜紧密结合，而细胞色素c 是电子传递链中唯一的外周蛋白，在线粒体呼吸链位于细胞色素b 和细胞色素aa3之间，位于线粒体内侧外膜，结合较松，较容易分离纯化。
每个细胞色素c 分子含有一个血红素和几条多肽链如图2-1，分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，pI 为9.8～10.8，相对分子质量为12000～13000D 。
它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性。
细胞色素c 分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素c 制成还原型。
氧化型细胞色素c 在408nm 、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素c 的最大吸收峰为415nm 、520nm 和550nm 。
在pH 为7.2～10.2，100℃加热3min ，细胞色素c 氧化型和还原型的变性程度均为18%～28%，增加加热时间，氧化型的不可逆变性比还原性高。
细胞色素c 对酸碱较稳定，可抵抗0.3mol/L 盐酸和0.1mol/L 的氢氧化钾溶液的长时间处理。
一般都将细胞色素c 制成稳定的还原型。
细胞色素c 溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。
其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。
通常外源性细胞色素c 不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素c 便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。
一般来说，组织的细胞色素c 的含量与它们的呼吸活性大致成平行关系，在心肌与其它剧烈运动的肌肉中含量最为丰富，在酵母中含量也比较丰富。
骨骼肌肌肉病理及染色
肌营养不良
BMD，冰冻，dystrophin C端抗 体免疫组化。显示C端正常
BMD, 冰冻，dystrophin N端抗体 免疫组化，显示N端肌膜染色消失
肌营养不良
先天性肌营养不良（merosin缺失 引起） ，肌纤维结构不正常， dystrophin免疫组化染色正常，
先天性肌营养不良， merosin缺 失，merosin免疫组化染色阴性
线粒体肌病
进行性眼外肌麻痹 (PEO)患者：无肌无力症状： SDH染色（左），COX染色(右)
线粒体肌病
线粒体肌病，电镜。肌原纤维间有巨大的线粒 体，大于一个肌小节，正常者远小于肌小节。 放大的线粒体内间结晶状物，正常的线粒体嵴 消失 。 形态异常的线粒体内有晶体状包涵物。
线粒体肌病
相对正常的线粒体
肌炎
正常人：MHC I 类分子免疫组 化：仅在血管壁有表达
皮肌炎患者：MHC I类分子广泛表达 于肌肉细胞膜和胞浆内
肌炎
皮肌炎，补体膜攻击复合物免疫荧光 染色，激素治疗后会消失
皮肌炎，电镜。血管内皮细胞内管 网状包涵体和胞饮小体
肌炎
包涵体肌炎，石蜡，HE。肌纤维右 侧正常，左侧正在受免疫细胞攻击
包涵体肌炎，冰冻，HE。肥大的肌纤维 和肌纤维分裂，肌萎缩为多角形类似于 神经源性肌萎缩，也见肌巨噬细胞
肌炎
包涵体肌炎，冰冻，HE。嗜伊红包涵 体周围被蓝色颗粒围绕，
包涵体肌炎患者：2型纤维受损， 1型纤维优势， ATP染色 pH 9.4
肌炎
包涵体肌炎：Gomori三色法，包 涵体不染色
包涵体肌炎：刚果红染色，包 涵体不染色
线粒体肌病，冰冻，细胞色素氧化酶 （COX），深棕色的为1型纤维，浅棕 色为2型，白色的为阴性
细胞色素C氧化酶染色
「临床意义」现代生物化学等学科中，所用细胞色素这一名称系指细胞内含铁元素蛋白质。
但是血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶和过氧化氢酶等除外，功能已经明确的细胞色素或是一种酶，或是氧化还原的载体。
应用二甲基萘二胺和α-萘酚做染料显示细胞色素C 氧化酶存在于骨髓细胞的胞浆内，相当于线粒体聚集的部位出现由棕褐色到灰蓝色颗粒。
因此应用细胞色素C氧化酶染色对研究细胞分化过程中细胞的分裂增殖十分有用。
原始红细胞内细胞色素C氧化酶颗粒不多，早幼红细胞、中幼红细胞细胞色素C氧化酶颗粒显著增多。
晚幼红细胞颗粒又明显减少。
这种现象与骨髓分化过程中的形态学特征相符合，在作细胞与细胞分裂相分类统计中，红细胞系统在正常情况下分裂增殖最旺盛的是早幼红和中幼红细胞，因此在这个分化阶段线粒体增殖，线粒体内的酶，尤其是电子传递系酶增多是完全可以理解的。
原始粒细胞胞浆内细胞色素C氧化酶颗粒不多，早幼粒细胞及嗜中性中幼粒细胞的全部胞浆内几乎充满了颗粒，但嗜中性晚幼粒及以及阶段仅有部分细胞含有很少颗粒。
说明粒细胞系统分裂增殖最旺盛的是早幼粒和嗜中性幼粒阶段。
淋巴细胞的细胞色素C 氧化酶颗粒主要集聚在胞浆的核凹陷处。
成熟红细胞和血小板不含有此酶。
细胞色素C的制备及其测定及思考题答案
细胞色素C 的制备及其测定及思考题答案一、实验原理1、通过细胞色素C 的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤；2、掌握制备细胞色素C 的操作技术及其含量的测定方法。
二、实验原理：细胞色素C 的特点与实验原理三、实验器材、材料及试剂：1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、纱布、广泛PH 试纸、精密PH 试纸、烧杯（2000、1000、500mL ）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；2、材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH 和1mol/L NaCl 混合液、（4）0.2% NaCl ，12%BaCl2，20%TCA ，2mol/L H2SO4、（5）0.06mol/L 磷酸氢二钠、0.4mol/L 氯化钠、（6）1%BaCl2三、实验步骤：1、细胞色素C 的制备：2.细胞色素C含量的测定：根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。
具体操作如下：(1)标准曲线的绘制配制细胞色素C标准母液（3.24mg/mL）。
按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A520nm），如图：（2）样品测定取纯化后的细胞色素C液1mL加水3mL，混匀，测A520nm。
如果光吸收值不在标准曲线范围内（0～0.30），应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。
五、结果计算：实验中测得的细胞色素C的光吸收值为：A520nm=0.266按照老师的计算公式(y=0.1675x)：样品浓度=1.588mg/mL我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)：样品浓度=1.594mg/mL原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。
骨骼肌肌肉病理及染色演示文稿
正常骨骼肌
Gomori三色，用于检测线粒体肌病、包 涵体肌炎、其它含包涵体的肌病，胞浆为 蓝绿色，
正常人PAS染色，显示糖原、黏多糖、 糖蛋白等，主要鉴别糖原累积症，也可 显示坏死、变性、血管结构、包涵体等
正常骨骼肌
Myosin重链慢型免疫组化染色，深 色为myosin 1型
Myosin重链快型免疫组化染色，深 色为myosin 2型，显示2型体积略大
肌炎
包涵体肌炎，冰冻，HE。有环的空 泡，严重的纤维化和肌萎缩
包涵体肌炎，电镜。中央和左下侧 管状纤维包涵体
肌炎
旋毛虫病
炎性肉芽肿
线粒体肌病
线粒体肌病，HE染色，肌纤维周边空泡
Gomori三色法，周边的线粒体聚集处 呈红色，为破碎红纤维
线粒体肌病
线粒体肌病，COX和琥珀酸脱氢酶(SDH) 双染，双染为灰褐色，COX为棕色， SDH为蓝色，周边深蓝的为聚集的线粒 体
线粒体肌病
进行性眼外肌麻痹 (PEO)患者：无肌无力症状： SDH染色（左），COX染色(右)
线粒体肌病
线粒体肌病，电镜。肌原纤维间有巨大的线粒 体，大于一个肌小节，正常者远小于肌小节。 放大的线粒体内间结晶状物，正常的线粒体嵴 消失 。 形态异常的线粒体内有晶体状包涵物。
线粒体肌病
相对正常的线粒体
5型糖原累积病，冰冻，PAS染色， 纤维中空泡含有PAS阳性物
5型糖原累积病，冰冻，淀粉酵素处理 后PAS染色，空泡内PAS阳性物消失， 证明为糖原
糖原累积病
正常人肌磷酸化酶活性染色，冰 冻，有黑色沉淀为阳性
5型糖原累积病，冰冻，肌磷酸化酶活性染 色，结果阴性即可诊断
拜托大家两件事
1、收集重症肌无力肌肉活检标本： 条件：重症肌无力Orsermann分型Ⅰ型、Ⅱa型、 Ⅱb型、Ⅲ型，
肌肉特殊染色
肌肉冰冻切片常用组织学及酶组织化学染色技术（—）苏木精和伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE）1．苏木精溶液染色10分钟2．流水冲洗10分钟2．伊红溶液染色3分钟4．流水冲洗1分钟5．梯度酒精脱水，透明树胶封固骨骼肌HE染色（肌膜核蓝色，肌纤维粉红色，结缔组织淡红色）（二）改良Gomori三色染色方法（Modified Gomori Trichrome, MGT）1．Harris苏木精10分钟2．水冲洗 10分钟3．Gomori氏溶液30分钟～60分钟4．0．2%醋酸浸洗1分钟5．酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。
骨骼肌MGT染色（核紫红,肌纤维暗绿色,胶原亮绿色 ,线粒体红色）（三）PAS反应法(Periodic Acid Schiffs reaction, PAS)1．固定于Carnoiy氏固定液10分钟2．流水冲洗2分钟3．0．5%过碘酸5分钟4．蒸溜水洗1～2分钟5．Schiff氏溶液15～30分钟6．流水洗5～10分钟7．Harris苏木精溶液2分钟8．流水洗5分钟9．脱水、透明、封固（合成树胶）骨骼肌PAS染色结果：糖原红色，肌内肌原纤维用清晰可见ⅡA纤维染色反应强，ⅡB、ⅡC、Ⅰ型纤维呈中间型。
（四）苏丹黑B染色1.苏丹黑溶液20分钟（加盖防气化）2．流水洗1．过滤的苏木精染1分钟4．流水洗2分钟5．甘油明胶封固结果：脂类物质染成黑色，。
（五）四氮唑还原酶(NADH—tetrarolium redutase, NADH—TR )1.孵育于下列基质内30分钟，37℃0.05M（或0.2M）Tric缓冲液（PH7.4） 30ml硝基四氮唑（BNT）30mgNADH 24mg2.蒸馏水洗。
3. 甘油明胶封固。
骨骼肌NADH－TR染色(Ⅰ型肌纤维紫兰色，Ⅱ型肌纤维淡灰色)。
（六）琥铂酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，SDH）染色步骤1．孵育于下列基质30分钟,37℃（琥泊酸钠100 mg 硝基四氮唑兰 10 mg 吩嗪二甲脂硫酸盐0.3 mg 0.1M Tris缓冲液30ml 调PH7.2 ）2．顺序在60%、90%、60%丙酮顺序脱水及蒸馏水清洗3．甘油明胶封固。
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NY: PFI 3499
CYTOCHROME OXIDASE PROTOCOL
PRINCIPLE:
Cytochrome oxidase (COX) is the collective name for Complex IV of the oxidative respiratory chain of enzymes located in mitochondria. This method is a modification of the "Nadi" reaction. The use of 3,3' diaminobenzidine (DAB) results in a brown insoluble compound at the site of cytochrome oxidase activity.
SPECIMEN REQUIRED:
Snap frozen human striated muscle
Controls:
Stain several different muscles simultaneously. There is normally always
enzyme activity present in muscle. The degree and location is interpreted. METHOD
None, use snap frozen tissue.
Fixation:
Technique: Cut 10 - 16 micron (12 µm) sections in cryostat from
snap frozen biopsy. Attach one or more sections to a No.1½,
22 mm square coverslip.
Equipment:
Ceramic staining rack - Thomas Scientific #8542-E40
Columbia staining dish - Thomas Scientific #8542-C12
- Thomas Scientific #8542-E30
dish(jar)
staining
Columbia
gloves
Forceps Latex
Reagents:
C-10)
Catalase
(Sigma
Cytochrome C (Sigma C-2506
water
deionized
3, 3' Diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma D-5637)
CARCINOGENIC, store at -20o C
Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH HAZARD
Reagent alcohol, ACS histochemical Fisher A962-4,or HPLC A995
FLAMMABLE, TOXIC, store at room temp. in flammable cabinet Sodium dibasic phosphate (Na2HPO4) anhydrous ACS
(FW 141.96)-Sigma S9763, Fisher S374, or Mallinckrodt 7917
Store at room temperature
Sodium monobasic phosphate (Na2HPO4) monohydrate (FW 137.99)
Store at room temperature
Sucrose -Sigma S7903, Store at room temperature
Xylenes - Fisher #HC700-1GAL, FLAMMABLE,
Store at room temperature in flammable cabinet)
NY: PFI 3499
Solutions:
I. 0.2 M Phosphate Buffer, pH 7.6 (at room temperature)
0.2 M sodium dibasic phosphate (Na2HPO4) anhydrous (28.39gm/liter
~95 ml
0.2 M sodium monobasic phosphate (Na2HPO4) Monohydrate
ml
(27.8
gm/liter deionized H2O) ~11 Add the monobasic to the dibasic while adjusting
the final pH to ~7.6 at room temperature.
II. Incubating Solution:
7 mg DAB
12 mg cytochrome C
20 µg catalase (approximately a few crystals)
750 mg Sucrose
5 ml 0.2 M Phosphate Buffer
5 ml deionized H2O
well.
Dissolve
III. Alcohol 50 % (v/v)
ml reagent
alcohol ~50
ml
water ~50
deionized
IV. Alcohol 70 %(v/v)
ml
alcohol ~70
reagent
ml
water ~30
deionized
V. Alcohol 80 % (v/v)
ml
alcohol ~80
reagent
ml
water ~20
deionized
VI. Alcohol 95 % (v/v)
alcohol ~95
ml reagent
ml
5
water ~
deionized
Staining Procedure
1. Place coverslips in the incubating solution in a columbia staining
dish (Thomas Scientific #8542-C12) for at least 1 hour but no more than 2 hours at
37o C or overnight at room temperature.
2. Wash with three exchanges of tap or deionized H2O.
3. Dehydrate in ascending alcohols (50%,70%,80%,95% x 2, 100% x 2) in
Columbia staining dish(jar) - Thomas Scientific #8542-E30.
4. Clear with at least 2 changes of xylene in Columbia staining dish -
Thomas Scientific #8542-E30
5. Mount with PERMOUNT or another synthetic organic mounting medium.
NY: PFI 3499
Results
Sites of cytochrome oxidase activity are colored brown.
REFERENCES
1. Seligman et al., 1968. In: HISTOCHEMISTRY - THEORETICAL and APPLIED, A.G. Everson Pearse, Vol. 2, 3rd Edition; Williams & Wilkins, Baltimore, 197
2.
12/26/2015。