光谱法研究细胞色素c氧化酶Cu_A结构域蛋白的稳定性
文献综述-蛋白质多级结构的表征方式及测定方法
文献综述蛋白多级结构的表征及测定方式摘要研究蛋白质的结构对生命科学有重要意义，因为明确了蛋白质的结构，有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质(或其它分子)之间的相互作用，这无论是对于生物学还是对于生物医学和生物药学，都是非常重要的。
蛋白质分子的多级结构可划分为四级，以描述其不同的方面，包括蛋白二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构。
关键词：二级结构超二级结构和结构域三级结构四级结构表征和测定方式1 蛋白多级结构概述蛋白质分子是由氨基酸首尾相连缩合而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象，即蛋白质的结构。
1.1 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构（secondary structure）是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。
蛋白质主链构象的结构单元包括：α-螺旋（α－helix）、β-片层结构（β－pleated sheet）或称β-折迭、β-转角（β－turn或β－bend）、无规卷曲（random coil）。
α-螺旋有以下几个特点：①多个肽键平面通过α－碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。
②主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。
③每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C=O之间形成氢键。
④肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。
β-片层结构有以下几个特点：①是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。
氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。
②依靠两条肽链或一条肽链的两段肽链间的C=O与H形成氢键，使构象稳定。
③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。
即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。
β-片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。
细胞色素C的制备及其测定及思考题答案
细胞色素C 的制备及其测定及思考题答案一、实验原理1、通过细胞色素C 的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤；2、掌握制备细胞色素C 的操作技术及其含量的测定方法。
二、实验原理：细胞色素C 的特点与实验原理三、实验器材、材料及试剂：1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、纱布、广泛PH 试纸、精密PH 试纸、烧杯（2000、1000、500mL ）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；2、材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH 和1mol/L NaCl 混合液、（4）0.2% NaCl ，12%BaCl2，20%TCA ，2mol/L H2SO4、（5）0.06mol/L 磷酸氢二钠、0.4mol/L 氯化钠、（6）1%BaCl2三、实验步骤：1、细胞色素C 的制备：2.细胞色素C含量的测定：根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。
具体操作如下：(1)标准曲线的绘制配制细胞色素C标准母液（3.24mg/mL）。
按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A520nm），如图：（2）样品测定取纯化后的细胞色素C液1mL加水3mL，混匀，测A520nm。
如果光吸收值不在标准曲线范围内（0～0.30），应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。
五、结果计算：实验中测得的细胞色素C的光吸收值为：A520nm=0.266按照老师的计算公式(y=0.1675x)：样品浓度=1.588mg/mL我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)：样品浓度=1.594mg/mL原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。
细胞色素C2
细胞色素C摘要1925年Keilin发现昆虫的飞翔肌中含有一种色素物质参与氧化还原反应，因这种色素物质有颜色，故命名为细胞色素。
细胞色素C是一类以卟啉为辅基的电子传递蛋白，在呼吸链中，依靠铁的化合价的变化来传递电子。
细胞色素位于线粒体内膜上，其中常见的细胞色素有五种：Cytb、Cytc、Cytc1、Cyta、Cyta3。
线粒体中的细胞色素大部分和内膜紧密结合，只有Cytc 结合较松，易于分离纯化，结构较清楚。
细胞色素C是一种水溶性蛋白，由核基因编码，分子量为12～13kDa，位于线粒体内膜的外侧，呼吸链复合体Ⅲ～Ⅳ之间，对线粒体能量代谢起重要的调节作用。
通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用，具有调控细胞能量代谢。
细胞色素C在细胞凋亡中的作用，只是近几年来才引起广泛关注。
从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用。
因此，细胞色素C与众多的疾病都有关，了解和研究细胞色素C就有助于我们临床医药上的应用有重要的意义，也与我们的息息相关，细胞色素C也是近几年来众多学者关注的问题之一。
细胞色素C的结构细胞色素C，就像在蛋白质数据编号3cyt中展示的那样，是一个电子载体。
就像很多携带电子的蛋白那样包含着可以携带电子的辅基。
细胞色素C含有一个铁原子的血红素基团，由红色展示。
由铁离子和释放电子。
周边蛋白质为电子提供了良好的环境，使其紧密的结合在细胞色素C上。
细胞色素C是一个非常古老的蛋白，在生命起源的早期便已产生。
因为这种至关重要的蛋白在细胞能量的产生中起着关至关重要的作用且千百万年来它几乎没有京华，所以细胞色素C在酵母的细胞和我们的细胞中并没有很大变化。
它们中有很多含有细胞色素C，用血红素和铁离子来转运电子，但是周边蛋白的变化使得它们的作用貌似神离。
而其他的载体用另外一些辅基来转运电子，比方说铁硫簇（就像铁硫蛋白那样），铜离子群（就像细菌氧化还原蛋白和质体蓝素那样）和其余的一些金属离子。
配位化学智慧树知到答案章节测试2023年
第一章测试1.配合物结构分为内界和外界（） A:错 B:对答案:B2.配位化学发展史上最早见于记录的配合物是（） A:普鲁士蓝KFe[Fe(CN)6]·nH2O B:二茂铁 C:大环配合物 D:蔡氏盐答案:A3.配位化学是无机化学的一个重要分支学科，它研究的对象是配合物。
（）A:错 B:对答案:B4.配位化学发展史上标志着配位化学研究的开始的配合物是（） A:二茂铁B:CoCl3· 6NH3 C:蔡氏盐 D:大环配合物答案:B5.无机物同样存在着几何异构、电离异构和光学异构现象。
（） A:错 B:对答案:B第二章测试1.在[Co(en)(C2O4)2]-中，Co3+的配位数是（）. A:4 B:6 C:2 D:3 答案:B2.下面配合物中，关于中心原子特征描述正确的是（） A:中心原子也可以是电中性的原子甚至阴离子 B:中心原子是指能提供空轨道的带正电阳离子 C:所有选项均正确 D:少数高氧化态的非金属元素也能作中心原子答案:C3.超分子配合物的概念是由下面那个化学家提出的（） A:罗勤慧 B:戴安邦 C:莱恩 D:道尔顿答案:C4.分子中既存在离子键，共价键还存在配位键的有（） A:AlCl3B:[Co(NH3)6]3+Cl3 C:KCN D:Na2SO4 答案:B5.超分子配合物的概念是由道尔顿提出的。
（） A:对 B:错答案:B第三章测试1.价键理论可以解释配合物的（） A:磁性和颜色 B:空间构型和颜色 C:颜色和氧化还原性 D:磁性和空间构型。
答案:D2.配合物的磁矩主要取决于形成体的（） A:成单电子数 B:电荷数 C:原子序数D:成对电子数。
答案:A3.晶体场理论的核心是（） A:M-L键由点电荷之间的作用形成 B:除了静电作用，包括轨道重叠的共价作用 C:配体的电子对转移到金属的杂化原子轨道中 D:Jahn-Teller效应答案:A4.下列配体的配位能力的强弱次序正确的为（） A:X->H2O>CH->NH3>NCS-B:CN->NH3>NCS->H2O>X- C:X->CN->H2O>NH3>NCS- D:CN->NH3>NCS->H2O>X- 答案:B5.IF5所具有的对称元素是（） A:一个对称面，一个对称中心 B:一个三重轴，三个二重轴，四个对称面，一个对称中心 C:一个五重轴，五个二重轴，六个对称面，一个对称中心 D:一个四重轴，四个对称面答案:D第四章测试1.下列离子中反位效应最大的是（） A:Br－ B:F－ C:Cl－ D:I－答案:D2.氧化还原方法合成配合物时，常用的氧化剂有（） A:K2Cr2O4 B:空气 C:过氧化氢 D:PbO2 答案:BCD3.在水热条件下，亚氨基二乙酸作为主配体构筑稀土配合物时易原位生成（）A:甲酸 B:丙酸 C:乙酸 D:草酸答案:D4.唯一能在原子级别上确定配合物结构的分析手段是（） A:红外 B:元素分析C:X射线单晶衍射法 D:质谱答案:C5.下列属于配合物单晶的培养方法是（） A:常规溶液法 B:水热或溶剂热法 C:金属热还原法 D:扩散法答案:ABD第五章测试1.配合物PtCl2(NH3)2为平面四边形，则它可能有的异构现象称为（） A:几何异构 B:旋光异构 C:配位异构 D:离解异构答案:A2.[VO(acac)2]的几何构型是（） A:四面体 B:八面体 C:三角双锥 D:四方锥答案:D3.配位数为6的配合物的空间构型有八面体和三棱柱等两种。
细胞色素c氧化酶研究新进展
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担着细胞色素 % & ’()*%+,*-. %/ %() % 0 到氧分子 & 1# 0 的电子传递功能 / 催化氧分子还原为水分 子 / 并与质子泵功能相偶联。催化反应式如下 2 3%() % & 4.# 5 0 5 67 5 & 89:8;. 0 5 1# < 3%() % & 4.= 5 0 5 37 5 & *>):8;. 0 5 #7# 1 形成水所需要的质子来源于细菌或线粒体内膜的内侧 / 而 %() % 则位于内膜的外侧。这种 底物间的隔离造成了电化学质子梯度的产生。另外 / ’%1 还有一种质子泵机制 / 即在传递电子 的同时/ 每个反应循环中伴随着 3 个质子由膜内侧泵向外侧。这样/ 进一步加剧了质子电化学 梯度的产生。生物体就是利用这种质子电化学梯度推动 ?@A 合成的/ ?@A 是许多生理过程所 必需的的直接能源。因此 / ’%1 在生物体的代谢过程中至关重要。 细胞色素 % 氧化酶是含血红素 B 铜 & +.-. B %*CC., 0 终端氧化酶 D 6/ E/ $$ F 大家族的成员之一。 这 个家族包括许多辅酶 G & >H8I>89*9. 0 氧化酶 / 例如 !" #$%& 细胞色素 H*= & %() H*= 0 等。含 +.-. B 0 中有与两个 +.-. 基团 %*CC., 终端氧化酶大家族的成员的特征是 / 在最保守的亚基! & J>H ! 和一个 ’> 离子 & ’>K 0 配位的组氨酸的存在。在细菌酶中 +.-. 基团可以是 +.-. ?、 K 或 1 D $$ F / 而在线粒体 ’%1 中仅发现存在 +.-. ?。亚基"& J>H "0 也非常保守 / 它含有双核 ’>? 中心/ 从 在辅酶 G 氧化酶中没有 ’>? 中心。 亚基 # & J>H # 0 也存在于所有线粒体和大 %() % 获得电子。 多数含 +.-. B %*CC., 终端酶的细菌中 / 在某些细菌中 J>H # & 或其中一部分 0 融合到 J>H ! 上。 由于这三个亚基存在于大多数含 +.-. B %*CC., 的终端酶中/ 所以 J>H ! 、 、 " #通常被称为核心 亚基。 细胞色素 % 氧化酶是由多个亚基组成的复杂酶分子。细菌 ’%1 一般含有 # L 3 个亚基/ 而 哺乳动物却由 $= 个亚基组成。’%1 催化核心亚基 J>H ! 中含有 +.-. M、 +.-. M= N’>K 金属活性 中心结构/ 核心亚基 J>H " 中含有 ’>? 的双核金属中心结构。J>H " 中的 ’>? 是接受来自 %() % 电子传递的初始受体 / 然后/ 它将电子依次传递给 +.-. M 和 +.-. M= N’>K / 最后/ 在 +.-. M= N’>K 双核中心处把氧分子还原为水分子。 在辅酶 G 氧化酶中没有 ’>? 中心/ 因此/ +.-. M 直接从辅 酶 G 获得电子。
生物氧化(一)
生物氧化(一)(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、{{B}}名词解释{{/B}}(总题数：6，分数：12.00)1.生物氧化(biological oxidation)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(营养物质在生物体内氧化成二氧化碳和水并逐步释放能量的过程称为生物氧化。
)解析：2.电子传递链(electron transfer chain)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(代谢物脱下的氢经一系列递氢体和递电子体的传递，最后把电子传递给氧，氢离子和氧离子结合生成水。
这一系列由递氢体和递电子体构成的链称为电子传递链。
由于该过程与细胞呼吸联系紧密，故称呼吸链。
)解析：3.氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(代谢物脱下的氢经呼吸链(电子传递链)传递与氧结合生成水的同时逐步释放能量，使ADP磷酸化生成ATP的过程称为氧化磷酸化。
具有电子传递与ADP磷酸化偶联的作用，是体内产生ATP的主要方式。
) 解析：4.底物水平磷酸化(substrate-level phosphorylation)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(糖酵解和三羧酸循环的某些反应步骤，由于脱氢或脱水等作用，使代谢物分子内部能量重新分布而形成高能磷酸化合物(或高能硫酯化合物)，然后将高能键转移给ADP(或GDP)生成ATP(或GTP)的反应称为底物水平磷酸化。
细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ可溶性结构域的结构改变、转换和功能研究
细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ可溶性结构域的结构改变、转换和功能研究细胞色素 c 氧化酶是哺乳动物线粒体或细菌呼吸链上的末端酶，催化电子从细胞色素 c 到 O2 的转移并使后者还原为水。
该酶是一个复合的膜蛋白，包括多个亚基及不同的金属活性中心。
其中，亚基II中的 CuA 中心被认为是电子从细胞色素 c 进入该酶的入口，在生理过程中起着重要作用。
细胞色素 c 氧化酶的缺损或不足可导致许多疾病，在一些退行性疾病 (如：老年痴呆症) 或癌症研究中已发现了与其相关的基因突变。
本工作以该酶的亚基 II 可溶区为研究对象，成功表达并获得了Paracoccus versutus 的细胞色素 c 氧化酶亚基II可溶区重组蛋白 (128-280位的氨基酸序列)；通过基因工程方法构建突变体蛋白，研究了 Trp121 和Val162氨基酸残基在该酶中的重要地位，报道了突变和其它物理化学因素引起的蛋白结构改变、转换，以及与此相关的性质和功能变化。
主要工作和结果如下：(一) 细胞色素 c 氧化酶亚基II可溶区蛋白的体外表达、纯化及性质表征以大肠杆菌BL21 (DE3) 为表达载体，建立并优化了表达条件，获得了细菌Paracoccus versutus 的细胞色素 c 氧化酶亚基II可溶区重组蛋白。
该蛋白大量存在于包涵体中，通过体外复性，金属中心重组和FPLC纯化，获得了水溶性的紫色蛋白，在SDS-PAGE中表现为单一条带。
经电喷雾质谱测定分子量，蛋白的成功制备得到了进一步确证。
采用紫外-可见和园二色谱表征了蛋白的金属活性中心和二级结构。
紫外可见光谱显示出明显的 CuA 特征，360，480，530 和 810 nm 的吸收带是双核混价铜中心的特有贡献；在园二色谱中，215 nm 附近的负峰是 (-折叠的典型特征。
这些光谱学特征与文献报导的同类蛋白质基本一致。
稳态荧光谱研究提供了有关亚基II可溶区的三级结构信息，细胞色素 c 氧化酶亚基II可溶区的最大荧光发射波长为342±2 nm，主要反映了色氨酸的荧光特征，表明存在着Tyr →Trp的能量转移；Apo-WT 蛋白的荧光较Holo-WT 强，表明 CuA 中心对蛋白荧光有淬灭作用。
细胞色素c氧化酶对衰老调控作用的研究进展
细胞色素c氧化酶对衰老调控作用的研究进展曹玲芳;李怡芳;何蓉蓉;栗原博【期刊名称】《国际药学研究杂志》【年(卷),期】2013(40)6【摘要】细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)是线粒体呼吸链的终端酶,位于线粒体内膜上,是呼吸链中唯一能够将氧还原成水的复合物.人体组织或细胞中90％的氧是通过COX催化处理后被利用的,COX在机体内的氧化代谢和ATP 合成中起着重要作用.研究发现,衰老及相关退行性疾病的发生均与COX活性减弱有关.本文从COX结构、亚基缺失、介导氧化损伤、与生物大分子结合等几个方面,综述COX对衰老等疾病的调控作用及相关机制,旨在为对预防或治疗老年性疾病提供参考.【总页数】7页(P751-756,777)【作者】曹玲芳;李怡芳;何蓉蓉;栗原博【作者单位】510632广州,暨南大学中药及天然药物研究所;510632广州,暨南大学中药及天然药物研究所;510632广州,暨南大学中药及天然药物研究所;510632广州,暨南大学中药及天然药物研究所【正文语种】中文【中图分类】R964;R977.3【相关文献】1.抗衰老酶1在心脏病中的作用及相关药物对其调控作用的研究进展 [J], 王杠杠;宋崴2.亚精胺调控细胞自噬在衰老和神经退行性疾病中的作用研究进展 [J], 尤雯雯;徐晓斌;张丽慧;杨怡3.自噬在心脏衰老过程中的作用及其调控机制研究进展 [J], 王烙佩;郑杰;李思敏;周志勇4.自噬在心脏衰老过程中的作用及其调控机制研究进展 [J], 王烙佩;郑杰;李思敏;周志勇;5.能量状态在果蔬采后衰老中的作用及其调控研究进展 [J], 李美玲; 林育钊; 王慧; 林毅雄; 林河通因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞色素C还原酶
复 合 体
Ⅳ 的 电 子 传 递 过 程
细胞色素c氧化酶CuB-Cyta3中心使O2还原成 水的过程，有强氧化性中间物始终和双核中心紧密
结合，不会引起细胞损伤。
（二）氧化呼吸链组分按氧化还原电位由低 到高的顺序排列
由以下实验确定:
标准氧化还原电位 拆开和重组 特异抑制剂阻断 还原状态呼吸链缓慢给氧
生物氧化的概念 物质在生物体内进行氧化称生物氧化
(biological oxidation)，主要指糖、脂肪、蛋白质
等在体内分解时逐步释放能量，最终生成CO2 和 H糖2O的过程。
脂肪 蛋白质
O2 CO2和H2O
能量
ADP+Pi ATP
热能
生物氧化与体外氧化之相同点
生物氧化中物质的氧化方式有加氧、脱 氢、失电子，遵循氧化还原反应的一般 规律。
粒体内膜的基质侧泵到内膜胞浆侧，产生膜 内外质子电化学梯度储存能量。当质子顺浓 度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。
化学渗透假说已经得到广泛的实验支持。
氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜； 线粒体内膜对H+、OH－、K＋、Cl－离子是不通
透的； 电子传递链可驱动质子移出线粒体，形成可测定
NADH（基质侧） CoQ（脂质核心） 琥珀酸（基质侧） CoQ（脂质核心） Cyt c（膜间隙侧）
Cyt c1， Cyt a Cyt c（膜间隙侧）
泛醌不包含在上述四种复合体中。
4H+
Ⅱ
琥珀酸
胞液侧
延胡索酸
QH2 Q
Ⅰ
基质侧
NADH+H+
NAD+
4H+
4H+ Cytc ox
光谱法研究细胞色素C与proliNONOate之间的相互作用
光谱法研究细胞色素C与proliNONOate之间的相互作用唐乾;宫婷婷;史珊珊;曹洪玉;王立皓;于勇;单亚明;郑学仿【摘要】It played an important role in the detection of mitochondrial apoptosis that the interaction of Cytochrome(Cyt c)with NO,thus the research is still a hotspot issue for the chemists and biologists.In this paper,Ultraviolet(UV-Vis)absorbance spectra,UV-Vis time course spectra,circular dichroism(CD),synchronous fluorescence spectra and electron paramagnetic resonance(EPR)technology were used to research the coordination reaction mechanism of different valence states Cyt c with proliNO/NO and its spatial conformation changes.The results showed that Cyt c could directly react with NO without other reagents.And its secondary structure would change during the experiment.It has been established that the electronic configurations of iron ions in porphyrin complexes are controlled in the nature by a number of axialligands,peripheral substituents attached to the porphyrin macrocycle,deformation of the porphyrin ring and solvent effects.During the experiment,proliNO/NO was added to the sample of Cyt c,and NO gas would generate,then entered into the solution,finally the distal methionine heme ligand was displaced,Cyt c could bind NO,that is,the Fe-S broke down,and the Fe-N formed.At the same time,generating a new cytochrome c-NO(Cyt c-NO)complex.Cyt c-NO binary complexes were instability and would dissociate,and dissociation process of Cyt c-NO binary complexes was belonging to a first-order reaction with thedissociation rate of(0.071 1±0.039 6)s-1.The secondary structure of Cyt c was affected by proliNO/NO concentration.When the concentrate of proliNO/NO was below to 8.6×10-4 mol·L-1,the peak changes of 222 nm and 208 nm was very weak,and the α-helix increased from 33.1％to44.1％.And it continued to increase,the secondary structure of Cyt c took place a great change.The tiny changes illustrated that a new compound generated,but excessive proliNO/NO can break the structure of Cytc.Taken together,we have demonstrated that an understanding of the interaction mechanism of NO with cytc,and the reaction mechanism of NO with ferri-and ferro-cytochrome c have important implications for the inhibition of mitochondrial oxygen consumption by NO and the mitochondrial metabolism of NO.%细胞色素C(Cytochrome,Cyt c)作为细胞内线粒体的电子传递体,与NO之间的相互作用结果对于线粒体凋亡的检测有着重要的生物学意义.采用紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱、电子顺磁技术(EPR)、时间过程光谱、圆二色(CD)光谱和同步荧光光谱等方法对处于不同价态的Cyt c与NO替代物,即proliNO/NO(proliNONOate)的相互作用过程,以及Cyt c在结合NO过程中蛋白空间结构的变化进行了详细研究.实验结果发现:在模拟生理条件下,不同价态的Cyt c都能够直接与NO替代物(proliNO/NO)所产生的NO发生配位反应.推断出Cyt c与NO之间相互作用发生的可能机制:NO与Cyt c结合过程,是因为与Cyt c中Fe配位的轴向配体以及卟啉周围的取代基变化而发生结合的.具体反应过程为:溶液中的NO诱导Cyt c中的Heme上Met80远离原来位置,Fe-S键断裂,进而空出的Fe与NO结合生成Fe-N键,从而生成新的Cyt c-NO配合物.研究表明:Cyt c-NO二元复合物不稳定,会发生光解离反应,通过线性拟合得出:其解离过程属于准一级反应,解离速率为(0.071 1±0.039 6)s-1.同时,血红素Fe与NO间新键的形成,影响了色氨酸和酪氨酸微环境的变化;Cyt c二级结构受proliNO/NO浓度的影响,当proliNO/NO浓度低于8.6×10-4 mol·L-1时,Cyt c的α-螺旋特征峰强度变化很小,且位置不变;但proliNO/NO浓度高于8.6×10-4 mol·L-1时,即过量,Cyt c的二级结构变化很明显,说明过量的NO能导致Cyt c二级结构的破坏.NO 与Cyt c配位反应机制的研究对于利用NO抑制线粒体内的氧气消耗,以及线粒体内NO的代谢具有重要的意义.【期刊名称】《光谱学与光谱分析》【年(卷),期】2017(037)008【总页数】8页(P2505-2512)【关键词】细胞色素C;proliNONOate;配位反应;解离【作者】唐乾;宫婷婷;史珊珊;曹洪玉;王立皓;于勇;单亚明;郑学仿【作者单位】大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省生物有机化学重点实验室,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省生物有机化学重点实验室,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省生物有机化学重点实验室,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省生物有机化学重点实验室,辽宁大连116622;辽宁省生物有机化学重点实验室,辽宁大连 116622;吉林大学生命科学学院,吉林长春 130012;吉林大学生命科学学院,吉林长春 130012;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省生物有机化学重点实验室,辽宁大连116622【正文语种】中文【中图分类】Q26生命体中血红素蛋白与小分子配体之间的配位反应广泛存在[1-2]。
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第21卷,第1期光 谱 实 验 室Vol.21,No.1 2004年1月Chinese J ournal of Sp ectrosco p y L aboratory January,2004光谱法研究细胞色素c氧化酶Cu A结构域蛋白的稳定性李连之(聊城大学化学化工学院 山东省聊城市 252059)宋爱新 黄仲贤(复旦大学化学系化学生物学实验室 上海市 200433)摘 要 利用荧光光谱和圆二色谱研究了细胞色素c氧化酶Cu A结构域蛋白的稳定性。
结果表明,随着溶液pH值的升高,Cu A结构域蛋白的稳定性降低。
随着温度的升高,Cu A结构域蛋白的二级结构遭到破坏。
脱金属形式蛋白的热稳定性减小,表明双核金属铜中心的存在对Cu A结构域蛋白的稳定性起重要作用。
关键词 细胞色素c氧化酶,Cu A结构域蛋白,荧光光谱,圆二色谱。
中图分类号:O657.32 文献标识码:A 文章编号:1004-8138(2004)01-0135-031 前言细胞色素c氧化酶是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的终端酶,它是由多个亚基组成的复合酶分子,其核心亚基Ⅱ中含有可溶性Cu A结构域。
Cu A结构域是一个高度离域化的混价双核金属中心结构[Cu+1.5—Cu+1.5],这是生物体系中的一种新颖的化学结构。
因此,研究Cu A结构域蛋白的各种性质,对进一步阐明细胞色素c氧化酶的作用机理和丰富发展金属酶的蛋白质化学都具有重要意义。
近年来,有关细胞色素c氧化酶的研究取得了重要进展[1,2]。
我们曾报道了细菌P ar acoccus versutus的细胞色素c氧化酶可溶性Cu A结构域的表达、分离纯化和初步表征[3]。
本文报道了在不同pH和温度下Cu A结构域的荧光光谱和圆二色散谱,以考察酸碱度和加热对Cu A结构域蛋白稳定性的影响。
2 实验部分2.1 仪器与试剂Cary Eclipse荧光分光光度计(VARIAN公司);Jasco J-715型圆二色谱仪(日本分光株式会社)。
Cu A结构域蛋白的制备参见文献[2]。
所用试剂均为分析纯。
2.2 apo-Cu A结构域蛋白的制备将20mm ol/L T ris·HCl(pH7.5)缓冲液配制的100 m ol/L Cu A结构域蛋白,对20mm ol/L Tr is·HCl(pH7.5),10mm ol/L EDT A的缓冲液在4℃下透析24h,透析过程中更换3—4次透析液,并监测Cu A结构域蛋白在530nm和806nm处的特征吸收,以确保完全去除铜离子。
国家自然科学基金重大资助项目(No.39990600)联系人,电话:(0635)8238486;E-mail:lilianzhil963@作者简介:李连之(1963—),男,山东省茌平县人,教授,博士,研究方向:生物大分子光谱学。
收稿日期:2003-07-012.3 Cu A 结构域蛋白对酸度稳定性的荧光光谱测量将Cu A 结构域蛋白加入不同pH 的缓冲液中,使Cu A 结构域蛋白的浓度均为1 m ol /L 。
在Cary Eclipse 荧光分光光度计上于室温下测量其荧光发射光谱。
激发光和发射光的狭缝的光谱宽度均为5nm,固定激发波长为280nm,扫描范围为290—450nm 。
2.4 Cu A 结构域蛋白对热稳定性的圆二色散谱测量移取0.4m L 浓度为16 m ol/L Cu A 结构域蛋白的20m mol/L 磷酸盐(pH 7.5)缓冲液,于光径为0.1cm 样品池中。
溶液上部覆盖一层石蜡油,防止溶液在较高温度下蒸发。
在不同温度(25—95℃)下,于Jasco J-715型圆二色谱仪上测量其圆二色散光谱(CD)。
测量时光源系统用N 2保护(流量为5L/m in)。
测量参数为:扫描速率100nm/min,分辨率0.2nm,响应时间0.25s 。
同样条件下测量apo -Cu A 结构域蛋白的CD 谱。
3 结果与讨论3.1 pH 对C u A 结构域蛋白荧光光谱的影响蛋白质是由许多氨基酸通过肽键按一定独特顺序连接起来的,其可离解的基团除了N -端的 -氨基和C-端的 -羧基外,实际上大多数是那些凸出侧链的基团,如天冬氨酸的 -羧基、组氨酸的咪唑、赖氨酸的!-氨基和酪氨酸的羟基等。
溶液中酸度的变化,主要是通过影响蛋白质中氨基酸残基的质子化或去质子化,从而影响蛋白质分子内部的静电作用和氢键来实现的。
改变溶液的pH 值,图1 pH 对Cu A 结构域蛋白荧光光谱的影响首先可以破坏分子中可离解基团之间的盐键,同时使蛋白质带有显著的静电荷。
由于同种电荷间的斥力作用,引起蛋白质结构的伸展,从而使其构象发生变化。
图1为不同酸度(pH 6.0—11.0)时的Cu A 结构域蛋白的内源性荧光光谱。
Cu A 结构域蛋白中含有8个酪氨酸(T yr )和5个色氨酸(Trp )残基,因而呈现出很强的荧光。
它的荧光激发谱的最大波长为280nm ,发射谱的最大波长为345nm [3]。
从图1中可以看出,随着pH 值的升高,荧光强度逐渐降低且峰位发生红移(从345nm 红移至350nm)。
荧光强度的下降可能与Cu A 结构域蛋白中Tr p 残基的量子产率降低及Ty r →T rp 能量传递有关。
随着pH 的升高,Cu A 结构域蛋白的负电荷增多,电荷间的斥力增大,使其结构变得更加松散,Trp 基团更加暴露于水极性溶剂中,导致峰位发生红移。
因为游离T rp 的发射峰位依据pH 值的不同,在351—361nm 范围内[4]。
3.2 Cu A 结构域蛋白对热稳定性的圆二色散谱Cu A 结构域蛋白主要是 -折叠的二级结构,其圆二色散谱在213nm 处有一明显的负吸收峰[3]。
图2为Cu A 结构域蛋白的热变性CD 谱。
从图2中可以看出,随着温度的升高,213nm 处的最大负吸收峰位逐渐发生蓝移,蛋白质的二级结构逐渐遭到破坏,由 -折叠的二级结构向无规卷曲形式过渡。
当温度小于45℃时,CD 谱变化不大,65℃是结构变化的突跃中点,75℃后CD 谱基本恒定,不再发生明显的变化。
温度升至95℃时仍有部分二级结构残存。
图3为脱金属形式的Cu A 结构域蛋白(apo -Cu A )的热变性CD 谱。
对于apo -Cu A 结构域蛋白来说,它的变化趋势与Cu A 结构域蛋白是一致的,但其变化强度有所不同。
Apo -Cu A 结构域蛋白结构变化的突跃中点是55℃,这个温度明显低于65℃。
从这里也可以看出,Cu A 结构域蛋白的热稳定性大于apo -Cu A 结构域蛋白。
这说明双核金属铜中心[Cu +1.5—Cu +1.5]不但是细胞色素c 氧化酶的活性中心[1,2],而且它的存在对于稳定蛋白质的结构也具有重要作用。
热变性作用是通过分子热运动的增强,使蛋白质分子由有序的结构变成松散的无序现象,而且经常会导致聚集体的形成。
这一过程主要是通过影响蛋白质分子中的静电力、氢键和疏水作用来实现的。
136光谱实验室第21卷4 结论利用荧光光谱和圆二色散谱,研究了酸度和加热等因素对Cu A结构域蛋白稳定性的影响。
图2 Cu A 结构域蛋白的热变性CD 谱图3 apo -Cu A 结构域蛋白的热变性CD 谱结果表明,随着pH 值的升高,Cu A 结构域蛋白的结构变得更加松散。
Cu A 结构域蛋白的热稳定性大于apo -Cu A 结构域蛋白,这说明双核铜中心[Cu +1.5—Cu +1.5]不但是电子传递的活性中心,而且也起着稳定整体蛋白分子结构的作用。
致 谢 细胞色素c 氧化酶可溶性Cu A 结构域蛋白的基因由荷兰Leiden U niversity 的Gerard W.Canters 教授惠赠,深表谢意。
参考文献[1]M ichel H ,Beh r J ,Harrenga A et al .Cytochrome c Oxidase :Struture and S pectros copy [J ].A nnu .R ev .Bio p hys .Biomol .S tru ct .,1998,27:329—356.[2]李连之,黄仲贤.细胞色素c 氧化酶研究新进展[J].无机化学学报,2001,17(6):761—774.[3]李连之,宋爱新,谢毅,黄仲贤等.细胞色素c 氧化酶可溶性Cu A 结构域的表达、分离纯化和初步表征[J ].科学通报,2001,46(12):1005—1008.[4]M elo E P,Costa S M B,Cabr al J M S.Denaturation of a Recom binant Cutinase from Fuearium Solani in AOT -Iso-Octane Re-vers e M icelles :a Steady -S tate Fluorescence Study [J ].P hotochem .P hotobiol .,1996,63:169—175.Studies on the Stability of Cu A Domain of Cytochrome c Oxidaseby Spectral MethodsL I Lian -Zhi (Sc hool of Chemistry and Ch emical E ngineering ,L iaocheng Univ er sity ,L iaocheng ,S handong 252059,P .R .China )S ONG Ai -Xin H UANG Zhong -Xian(Chemical B iology L aboratory ,Dep artme nt o f Chemistry ,Fud an Univ er sity ,Sh anghai 200433,P .R .China )AbstractThe stability o f Cu A dom ain of cy tochrom e c ox idase w as investigated by fluorescence spectra and circular dichroism spectra .T he results sho wed that the stability of Cu A do main decreased w ith the increasing of pH ,and its seco ndar y str ucture w as destroy ed w ith the increase of temperature .The thermal stability o f apo-Cu A domain is higher than that of Cu A domain,w hich sugg ested that the binuclear m etal center [Cu A +1.5—Cu A +1.5]also plays an important role on the structural sta-bility of the pro tein .Key words Cy tochrom e c Oxidase,Cu A Dom ain,Fluorescence Spectra,Circular DichroismSpectra.137第1期李连之等:光谱法研究细胞色素c 氧化酶Cu A 结构域蛋白的稳定性。