脱氢酶测定方法
脱氢酶测定实验报告
1. 了解脱氢酶的特性和作用机制。
2. 掌握脱氢酶测定实验的方法和原理。
3. 学会使用分光光度计进行脱氢酶活性的测定。
二、实验原理脱氢酶是一类催化氧化还原反应的酶，可以将底物中的氢原子转移给辅酶，从而实现底物的氧化。
本实验以乳酸脱氢酶（LDH）为例，通过测定其在特定条件下催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率，来间接反映LDH的活性。
三、实验材料1. 乳酸脱氢酶（LDH）提取液2. 乳酸（底物）3. 丙酮酸（产物）4. 磷酸缓冲液5. 分光光度计6. 移液器7. 试管8. 秒表四、实验方法1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取一定量的磷酸缓冲液，加入LDH提取液，作为对照组。
3. 设置实验组：取一定量的乳酸，加入LDH提取液，作为实验组。
4. 测定吸光度：将对照组和实验组的试管放入分光光度计中，在特定波长下测定吸光度。
5. 计算反应速率：根据吸光度变化，计算LDH的活性。
1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取1ml磷酸缓冲液，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A0。
3. 设置实验组：取1ml乳酸，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A1。
4. 加入丙酮酸：向实验组中加入1ml丙酮酸，混匀后立即放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A2。
5. 计算反应速率：计算A1与A0的差值（ΔA），ΔA表示在反应过程中吸光度的变化。
根据反应速率公式：反应速率= ΔA / Δt其中，Δt为反应时间，本实验中Δt为1分钟。
六、实验结果与分析1. 通过实验，成功测定了LDH的活性，得到实验数据如下：A0 = 0.3A1 = 0.6A2 = 0.92. 计算反应速率：ΔA = A1 - A0 = 0.6 - 0.3 = 0.3Δt = 1分钟反应速率= ΔA / Δt = 0.3 / 1 = 0.33. 结果分析：根据实验结果，LDH在1分钟内催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率为0.3。
乳酸脱氢酶测定—速率法(精)
430
37 要
4920
20 600
U/L
430
37 要
30s
45s
3016
50 900
80 + 2 0. 0 2
参考范围:104-205U/L 式中6 220为波长340nm处NADH的摩尔 吸光度。
方法评价
1.L-P反应速率法是根据正向反应而建立，其优点在
于：乳酸盐和底物溶液的稳定性较好，－20℃保存 可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的 影响最小。 2.线性范围较宽 本法在LDH活性为726U/L以内时 线性良好。超过此值最好将标本稀释后再测。 3.精密度好 LDH活性为65U/L时，日间CV为5.8%； LDH活性为149U/L时，日间CV为3.2%。 4.特异性高 由于血清中非LDH的NAD＋类氧化还原 酶的内源性底物很少，加上样本的高度稀释，因此， 这些酶的干扰作用可忽略不计。
LDH pH 8.8 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H
实验操作
样本要求:当日空腹采集的无溶血、无乳糜的
血清 试剂配制：取R15ml加R21ml混合即为工作试 剂 半自动生化分析仪测定参数
半自动生化分析仪测定参数
分 析 方 法 速 率 法 速 率 法 波长 温 度 试 剂 空 白 延 迟 时 间 30s 测 量 时 间 45s 因数 样 品 量 uL 试 剂 量 uL 吸 入 量 uL 500 单 位 反 应 方 向 正
乳酸脱氢酶测定—速率法
xiaobinxuer@
实验目的
熟悉血清乳酸脱氢酶测定（速率法）的原理，
测定参数的设置及酶活性单位的计算
实验原理
乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时
脱氢酶活性的测定
脱氢酶活性的测定一.实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二.实验原理活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。
参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。
其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。
如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。
因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。
脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。
利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。
三.实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2．4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g 葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。
3. Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）：称取 6.037g Tris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯），再加入20ml 1mol/L的盐酸，再定容至1L。
4. 10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。
5. 无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。
四.实验步骤1．标准曲线的绘制⑴不同浓度的TTC系列溶液的配置：从TTC溶液中移取1，2，3，4，5，6，7mL放入七个50mL的容量瓶中，定容到50mL。
⑵取7支试管，分别加入2mL Tris-HCl缓冲溶液、2mL无氧水、2mL不同浓度的TTC溶液,第八支为对照组。
脱氢酶活性的测定
（1）取液氮保存的种子和对照（保存在冰箱4度）种子，设置三个重复，每个重复25粒种子，在无菌水浸种24-28h，使种胚吸胀，小心无伤取胚，再进行TTC染色法。
（2）将种胚置于试管内，加入0.1%TTC溶液（磷酸缓冲液配制）5毫升，试管加塞，在35度黑暗条件下染色2小时。到时间后，倒出TTC液，用水冲洗2~3次，用滤纸吸取种子表面水分。
对照（低温冰箱保存）
等等
实验器材和试剂：
试剂：
1.乙醇2000毫升（4瓶）
2.磷酸缓冲液pH 7配制见生化实验指导书。
磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制
3TTC
仪器：
分光光度计
水浴锅
磁盘
滤纸
带塞试管50
小镊子2把
（3）将吸干水分的种子倒入干燥的试管，加入8毫升无水乙醇，将试管置于80度水浴中提取红色物质，待胚部变白色后（约6-8小时）停止提取，冷却后将提取液出比色。
（4）以无水乙醇为参照（较零），在485nm波长测定光密度值（OD）.
3数据录用方式（录入EXCOL），形式如下
品种
OD1
OD2
OD3
平均值
小红豆（液氮保存）
脱氢酶性的测定（参照胡晋的论文“对种子活力测定方法-TTC定量法的改进）
1、实验原理
TTC（三苯基四氮唑）接受活种子代谢过程中呼吸链上的氢，变成还原态的红色的TTCH（三苯基甲-）。TTCH不溶于水，溶于乙醇。可用乙醇提取，红色愈深，表明种子活力愈高。提取液用分光光度计比色，光密度值越高，活力越强。
细菌脱氢酶活性的测定
细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定摘要休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，是测定细菌脱氢酶活性的良好材料。
本实验用E.coli cVcc249菌株作为实验材料，制备其休止细胞，再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的α-酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度，研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。
在本次实验中，所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑盐还原法，噻唑盐宜与反应生成的还原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，可溶解于二甲亚砜中，再根据其颜色变化的深浅，用分光光度计测其OD510nm值，即可表示细菌脱氢酶的活性。
AbstractThe resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration, the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, α-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of α-ketoglutaric acid and sodium citrate perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purple crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.关键词休止细胞脱氢酶活性α-酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐1.引言1.1 休止细胞1.1.1 休止细胞的定义及特性休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。
LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。
由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。
（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。
某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。
此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。
300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。
因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。
血清溶血可使测定值增高，应予以注意。
500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。
三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
土壤脱氢酶测定方法
土壤脱氢酶测定方法土壤脱氢酶可是个很有趣的研究对象呢。
那怎么测定它呢？一种常见的方法是采用三苯基四氮唑氯化物（TTC）法。
这就像是一场土壤里的小魔术。
我们先把含有脱氢酶的土壤样品取出来，然后加入TTC溶液。
脱氢酶在土壤里就像一个个小工匠，它会把TTC变成一种红色的东西，叫三苯基甲臜（TF）。
这个过程就像是小工匠把普通的材料加工成了漂亮的工艺品。
接下来呀，就要把这个反应后的土壤溶液进行处理啦。
我们得想办法把TF从土壤里提取出来呢。
这时候就需要用到有机溶剂，比如说丙酮之类的。
把丙酮加进去，像给土壤洗个特别的澡，让TF乖乖地跑到丙酮里。
然后呢，我们就可以用分光光度计这个神奇的小仪器来测量啦。
把含有TF的丙酮溶液放到分光光度计里，它就能告诉我们TF的含量。
因为TF的含量和土壤脱氢酶的活性是有关系的，就像小工匠的作品数量能反映出小工匠的工作能力一样。
还有一种方法是碘硝基四氮唑蓝（INT）法。
这个方法也很有意思哦。
同样先把土壤样品准备好，再加入INT溶液。
土壤里的脱氢酶就会对INT动手脚啦，把它变成一种有色的产物。
然后也是通过提取这个有色产物，再用分光光度计去测量。
不过在做这些测定的时候，要特别小心呢。
土壤样品的采集就很有讲究，要确保采集的样品能代表要研究的那片土壤。
就像挑苹果，要挑到能代表一整筐苹果好坏的那个。
而且在整个测定过程中，温度、pH值这些条件都要控制好。
如果温度不合适，就像小工匠在寒冷或者炎热的环境里工作，会影响他们的工作效率，也就是脱氢酶的活性测定结果啦。
pH值也是一样的道理，太酸或者太碱，小工匠们也会不开心，测定结果就不准啦。
土壤脱氢酶的测定方法虽然有点小复杂，但就像探索一个神秘的小世界，充满了乐趣呢。
乙醛脱氢酶测定方法
乙醛脱氢酶测定方法
需要注意的是，具体的实验步骤和条件可能因实验目的、样品类型和实验室设备而有所不 同。在进行乙醛脱氢酶测定前，应参考相关的步骤： 1. 准备一组试管，每个试管中加入以下试剂（体积可根据需要调整）： - 0.1 M 磷酸盐缓冲液 1 mL - 0.1 M 乙醛溶液 0.1 mL - 待测样品 0.1 mL（如果有） 2. 在每个试管中加入适量的乙醛脱氢酶溶液，使最终体积为2 mL。 3. 在每个试管中加入适量的NAD+溶液，使最终体积为3 mL。 4. 将试管放入37°C的恒温水浴中，孵育一定时间（通常为10-30分钟）。
乙醛脱氢酶测定方法
5. 孵育结束后，使用分光光度计测量每个试管中的吸光度。乙醛脱氢酶催化乙醛氧化生 成乙酸，同时还伴随着NAD+还原为NADH。通过测量NADH的吸光度变化，可以间接测定 乙醛脱氢酶的活性。
6. 使用一个空白试管作为对照，其中不加入乙醛溶液，其他步骤相同。
3. 数据分析： - 计算每个试管的吸光度差值（样品试管减去空白试管）。 - 根据已知的标准曲线或对照样品，将吸光度差值转换为乙醛脱氢酶的活性。
乙醛脱氢酶测定方法
乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是一种酶，主要参与乙醛的代谢过程 。以下是一种常用的乙醛脱氢酶测定方法：
1. 材料准备： - 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4） - 0.1 M 乙醛溶液 - 0.1 M NAD+（辅酶）溶液 - 待测样品
乙醛脱氢酶测定方法
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脱氢酶测定（比色法）（关松荫）
试剂
1）1% TTC
2）CaCO
3
3) 甲醇
4）甲臢（TPF）的标准溶液：用TTC还原配制。
TTC标准溶液：称取50mg已烘干的TTC于50ml的容量瓶中，加水定容，得1mgTTC/ml的标液（1000ug/ml）。
标准曲线的绘制：将TTC标准溶液配制成2、4、6、8、10、20、30 ug/ml
还原，显色后在分光光度计上于的三苯基四唑氯化物溶液，分别加10mg NaHSO
3
460nm处比色测定并绘制标准曲线。
操作步骤
取20g土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸钙。
混匀后加2ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%（5d），在恒温恒湿培养箱中（30℃，相对湿度70%）培养24h。
培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min，过滤。
再用甲醇多次洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。
合并滤液和洗液并定容50ml或100ml，在分光光度计上于460nm处比色（以甲醇做空白）。
不加土及TTC做一个空白对照。
结果计算
酶活性表示：根据减去空白对照的光密度值查标准曲线即可求出产生的三苯基甲臢的量，该量（ug/g干土）即表示脱氢酶的活性。
土壤脱氢酶活性（ugTPF/g干土）=C*V/dwt 或根据形成1mg三苯基甲臢需要150.35ul氢，也可以转移氢的体积表示。
X=av*150.35
式中：C——滤液中TPF的量（ug/ml）（由标曲查知）
a——1ml滤液中TPF的毫克数（查标准曲线）
V——滤液体积（ml）
dwt——烘干土的质量（g）
150.35——将TPF量换算成氢的体积（ul）的系数。