2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解
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第二次实验课、DNA片段扩增及DNA连接
讲解内容 一、PCR实验背景 二、PCR基本原理 三、PCR引物设计原则 四、 PCR反应注意事项 五、常见问题与对策 六、 PCR的应用
一．实验背景
• The polymerase chain reaction (PCR) is invented by K. Mullis in 1985. • This technique is used to amplify a specific sequence of DNA in vitro by simulating the replication procedure of natural DNA in vivo.
在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下， 特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
在一微量离心管中依次加入下列试剂： 模板（DNA或cDNA） 10PCR buffer（含MgCl2） dNTPs (10mmol/L) 5’引物 (10mol/L) 2 l 5 l 1 l 1 l 50l
引物设计
1、GC比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条 氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的 重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半。 2、引物特异序列的长度至少为15-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永远是5‘→3’方向，正向（Sense） 引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引 物则与这股模板DNA序列相互补。 4、 引物的酶切位点：通常在引物的5‘-端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。 5、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。 6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´
3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
7.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点； 引入点突变、插入突变、缺失突变序列； 加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。 引入启动子序列等。 标记生物素、荧光、地高辛等； 引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能 有形成任何二级结构可能。
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
95℃
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 引物1
DNA引物
引物2
50℃
50℃
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
1 2 模板DNA 3
• PCR反应条件 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
72 oC
1 min
72 oC
产物链延伸
10 min
25-30个循环后
介绍：PCR仪
如果上盖加热的PCR仪，可以直接放 入仪器中进行PCR；
如果下面加热的PCR仪，加入2滴 矿物油后，加入仪器中，不过这 种仪器现在已经很少用到。
PCR仪内发生的反应
变性
退火
5 5
延伸
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
引物长度要确保Tm值不低于54°C。
6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物内部不应存在互补序列。 以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按经验， 不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3’末端一般不达到 3 bp。 引物间不应存在互补序列。 尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体。
引物3′端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G和C。
4. 碱基要随机分布。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免出现嘌呤，嘧啶的 堆积现象。
5.引物GC含量在45-55% (40%~60%)之间，Tm 值最好接近72℃。
上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。 引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温 度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。 若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有 效引物的Tm为55~80℃。Tm值最好接近72℃。 退火温度：一般低于Tm值2~10℃。
在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影 响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中， 这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去， 所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含 有两侧引入的核苷酸序列。
8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp。 过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。
2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性比较软件（比如 DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。
引物3′端要避开密码子的第3位。 因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使 其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）
Primers That Form Hairpins
• A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin.
• The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.
The Nobel Prize in Chemistry 1993
体外扩增特异DNA片段
• PCR enable us to unlimitedly amplify DNA fragments.
二．PCR基本原理
target sequence
3’ 5’ PCR 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’
3.引物3’端是DNA延伸的起点，因此一定要严 格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8 个碱基要求与模板严格互补。 但引物的3′端最好没有连续3个G和C。否则会 使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。 引物3′端最好选择T？
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末 位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引 发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
PCR的基本原理
Taq酶
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
72℃
72℃
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
95℃PCR的基本原理 NhomakorabeaTaq• PCR反应条件 95℃ Taq PCR过程 • • PCR的特点
9. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响， 选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
10. 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源 性。与模板之间的特异性结合序列一般不少 于15-18bp。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果 与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实 验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的 模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低， 导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目 的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择 自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满 足条件。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构 内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当 选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值 不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点 形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可 以用Oligo 6软件进行分析）
反应分三步：
① 变性（denaturation）； ② 退火（annealing）； ③ 延伸（extension）
pre-denaturation 95℃ for 5min;
Denaturation: 95℃ for 30~60s
Annealing: 37~68℃ for 30~60s extension: 72℃ for 30s~2min 72℃ extension for 10 min 30 cycles
三、PCR引物的设计
• PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。 引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引 物与模板的特异结合。 • PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。
引物设计 的 基本原则
引物的设计实例 (＊)
PCR 引物设计 的 基本原则
1.引物的方向永远是 5→3 引物长度一般在15~30核苷酸之间。
5´-GTTGACTTGATA
T
3´-GAACTCT
Primers That Form Dimers • Primer pairs should be checked for complementarity at the 3'-end. This often leads to primer-dimer formation with itself or with the other primer. • Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.
小结: 引物设计时应遵循的原则 (＊) General rules for Primer design
(1)specificity: conserved genomic region. <75% homologous with other region. Specially, 8 bases at 3’end. (2) specific sequence length: 15/18～30 base. (3)G+C contents＝45-55%. ATCG random distributed (4) Avoid hairpin in each primer, specially at 3’end. (5) Avoid complement between primers (4bp以上）, specially at 3’end. (6) unique restriction enzyme sites can only be added to the 5’ end of the primers. (7) T is the best candidate at 3’ end ？
3’引物 (10mol/L)
去离子水（补足反应体系） Taq DNA pol. (2U/l)
1 l
39 l 1 l
轻弹管底混合（用离心机甩一下） •加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。
一般地，基因片段在500-1000bp左右时，
可按下列条件进行PCR： PCR仪设定的反应条件： 94oC 55 oC 45 S 45 S DNA变性 DNA复性
50℃
Taq
72℃
Taq
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
72℃
第2轮结束
PCR产物的积累规律
反应初期，目的DNA片段呈 指数扩增。随着目的DNA产 物逐渐积累，在引物、模板 与DNA聚合酶达到一定比例 时，酶的催化反应趋于饱和， 此时扩增DNA片段的增加减 慢进入相对稳定状态，即出 现“停滞效应”，又称“平 台期”。到达平台期所需 PCR循环次数取决于样品中 模板的拷贝数、PCR扩增效 率等因素。
讲解内容 一、PCR实验背景 二、PCR基本原理 三、PCR引物设计原则 四、 PCR反应注意事项 五、常见问题与对策 六、 PCR的应用
一．实验背景
• The polymerase chain reaction (PCR) is invented by K. Mullis in 1985. • This technique is used to amplify a specific sequence of DNA in vitro by simulating the replication procedure of natural DNA in vivo.
在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下， 特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
在一微量离心管中依次加入下列试剂： 模板（DNA或cDNA） 10PCR buffer（含MgCl2） dNTPs (10mmol/L) 5’引物 (10mol/L) 2 l 5 l 1 l 1 l 50l
引物设计
1、GC比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条 氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的 重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半。 2、引物特异序列的长度至少为15-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永远是5‘→3’方向，正向（Sense） 引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引 物则与这股模板DNA序列相互补。 4、 引物的酶切位点：通常在引物的5‘-端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。 5、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。 6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´
3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
7.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点； 引入点突变、插入突变、缺失突变序列； 加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。 引入启动子序列等。 标记生物素、荧光、地高辛等； 引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能 有形成任何二级结构可能。
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重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
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时间（min）
4
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 引物1
DNA引物
引物2
50℃
50℃
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2
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重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
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条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
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时间（min）
4
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PCR的基本原理
1 2 模板DNA 3
• PCR反应条件 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
72 oC
1 min
72 oC
产物链延伸
10 min
25-30个循环后
介绍：PCR仪
如果上盖加热的PCR仪，可以直接放 入仪器中进行PCR；
如果下面加热的PCR仪，加入2滴 矿物油后，加入仪器中，不过这 种仪器现在已经很少用到。
PCR仪内发生的反应
变性
退火
5 5
延伸
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
引物长度要确保Tm值不低于54°C。
6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物内部不应存在互补序列。 以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按经验， 不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3’末端一般不达到 3 bp。 引物间不应存在互补序列。 尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体。
引物3′端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G和C。
4. 碱基要随机分布。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免出现嘌呤，嘧啶的 堆积现象。
5.引物GC含量在45-55% (40%~60%)之间，Tm 值最好接近72℃。
上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。 引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温 度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。 若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有 效引物的Tm为55~80℃。Tm值最好接近72℃。 退火温度：一般低于Tm值2~10℃。
在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影 响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中， 这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去， 所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含 有两侧引入的核苷酸序列。
8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp。 过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。
2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性比较软件（比如 DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。
引物3′端要避开密码子的第3位。 因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使 其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）
Primers That Form Hairpins
• A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin.
• The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.
The Nobel Prize in Chemistry 1993
体外扩增特异DNA片段
• PCR enable us to unlimitedly amplify DNA fragments.
二．PCR基本原理
target sequence
3’ 5’ PCR 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’
3.引物3’端是DNA延伸的起点，因此一定要严 格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8 个碱基要求与模板严格互补。 但引物的3′端最好没有连续3个G和C。否则会 使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。 引物3′端最好选择T？
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末 位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引 发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
PCR的基本原理
Taq酶
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
72℃
72℃
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
95℃PCR的基本原理 NhomakorabeaTaq• PCR反应条件 95℃ Taq PCR过程 • • PCR的特点
9. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响， 选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
10. 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源 性。与模板之间的特异性结合序列一般不少 于15-18bp。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果 与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实 验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的 模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低， 导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目 的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择 自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满 足条件。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构 内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当 选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值 不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点 形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可 以用Oligo 6软件进行分析）
反应分三步：
① 变性（denaturation）； ② 退火（annealing）； ③ 延伸（extension）
pre-denaturation 95℃ for 5min;
Denaturation: 95℃ for 30~60s
Annealing: 37~68℃ for 30~60s extension: 72℃ for 30s~2min 72℃ extension for 10 min 30 cycles
三、PCR引物的设计
• PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。 引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引 物与模板的特异结合。 • PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。
引物设计 的 基本原则
引物的设计实例 (＊)
PCR 引物设计 的 基本原则
1.引物的方向永远是 5→3 引物长度一般在15~30核苷酸之间。
5´-GTTGACTTGATA
T
3´-GAACTCT
Primers That Form Dimers • Primer pairs should be checked for complementarity at the 3'-end. This often leads to primer-dimer formation with itself or with the other primer. • Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.
小结: 引物设计时应遵循的原则 (＊) General rules for Primer design
(1)specificity: conserved genomic region. <75% homologous with other region. Specially, 8 bases at 3’end. (2) specific sequence length: 15/18～30 base. (3)G+C contents＝45-55%. ATCG random distributed (4) Avoid hairpin in each primer, specially at 3’end. (5) Avoid complement between primers (4bp以上）, specially at 3’end. (6) unique restriction enzyme sites can only be added to the 5’ end of the primers. (7) T is the best candidate at 3’ end ？
3’引物 (10mol/L)
去离子水（补足反应体系） Taq DNA pol. (2U/l)
1 l
39 l 1 l
轻弹管底混合（用离心机甩一下） •加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。
一般地，基因片段在500-1000bp左右时，
可按下列条件进行PCR： PCR仪设定的反应条件： 94oC 55 oC 45 S 45 S DNA变性 DNA复性
50℃
Taq
72℃
Taq
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
72℃
第2轮结束
PCR产物的积累规律
反应初期，目的DNA片段呈 指数扩增。随着目的DNA产 物逐渐积累，在引物、模板 与DNA聚合酶达到一定比例 时，酶的催化反应趋于饱和， 此时扩增DNA片段的增加减 慢进入相对稳定状态，即出 现“停滞效应”，又称“平 台期”。到达平台期所需 PCR循环次数取决于样品中 模板的拷贝数、PCR扩增效 率等因素。