限制性片段长度多态性
RFLP限制性片段长度多态性
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RFLP中应用的限制性内切酶
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限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，丌同的内切酶可辨认并作用亍特 异的DNA序列，并将 DNA切断。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。
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RPLF技术的原理
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利用特定的限制性内切酶识别并切割丌同生物个体的基因 组DNA，得到大小丌等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上丌同酶切位点的分布 情冴。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成丌同带，然后不兊隆 DNA探针迚行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由亍丌同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切収生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。
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数据分析
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（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （四）从冰箱中叏出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
RFLP
限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。
它是第一代DNA分子标记技术。
Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。
DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。
所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。
当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。
分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。
分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。
不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。
分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。
构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。
1 原理该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。
如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。
第五章分子标记技术原理与应用
AFLP标记的基本原理是基于PCR技术扩增基因 组DNA限制性片段，基因组 DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头 连接到DNA片段的末端，接 头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结 合位点。限制性片段用两种 酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用 切割酶。
分子标记的应用
获得与目标性状连锁的分子标记
分子标记辅助育种的经典例子
美国科学家将分子选择应用在玉米杂种优势遗传改良上，经过改良的B73 改良的Mo17的组合比原始的B73 Mo17组合和一个高产推广组合 Pioneer hybrid 3165皆增产10%以上（Stuber and Sisco 1991; Stuber et al. 1995）。 通过分子标记技术将3个抗稻瘟病基因（Pi-2、Pi-1和Pi-4）在水稻第6、 11和12号染色体上进行定位，然后利用连锁标记将这3个抗性基因聚合起 来。基因聚合试验从3个分别带有Pi-2、Pi-1和Pi-4基因的近等基因系 C101LAC、C101A51和C101PKT出发，已成功地获得聚合了这3个抗稻瘟病 基因的植株，它们可以作为供体亲本在育种中加以利用，可同时提供数 个抗性基因。 （Zheng et al. 1995）
一、限制性片段长度多态性技 术(RFLP)
限制性片段长度多态性技术(RFLP)是用已知的 限制性内切酶消化目标 DNA，电泳印迹，再用DNA探针杂交并放射自 显影，从而得到与探针同源 的DNA序列酶切后在长度上的差异。 RFLP标记在正常的分离群体中都呈典型的孟德 尔式遗传。PFLP的结果稳 定，在作物基因图谱构建和QTL基因定位分析 上使用较多。
三、简单重复序列SSR
第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析
第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。
动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman 1983）。
提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。
mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。
在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。
更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。
生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。
ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。
强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。
如何用PCR法检测基因的多态性
如何用PCR法检测基因的多态性多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。
在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。
这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。
基因多态性的主要检测方法简述如下：1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，钠问亢兔扛銎蔚某ざ染筒煌此降南拗菩云纬ざ榷嗵裕贾孪拗破纬ざ确⑸谋涞拿盖形坏悖殖莆嗵晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。
现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。
2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。
相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。
在电泳时泳动的速度不同。
将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。
3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。
在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。
其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。
突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。
RFLP名词解释
RFLP名词解释RFLP是限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的缩写，是一种分子生物学技术，常用于分析DNA样本中的基因型。
下面对RFLP进行详细解释，包括其原理、应用和优缺点。
RFLP技术是基于DNA序列的差异来检测个体间的基因型差异。
它利用了DNA序列中的限制性内切酶剪切位点的多态性，通过对DNA样本进行酶切和凝胶电泳，分析得到的DNA片段长度的差异来判断个体的基因型。
RFLP技术的原理如下：1. 获取DNA样本：从个体的细胞中提取DNA样本，可以通过多种方法如血液、唾液、组织样本等获得。
2. DNA酶切：用特定的限制性内切酶对DNA样本进行酶切。
限制性内切酶是一种具有特异性的酶，它会识别和切割特定的DNA序列。
如果个体的DNA序列中存在特定的切割位点，则酶切会产生不同长度的DNA片段。
3. 凝胶电泳：将经过酶切的DNA样本加载到凝胶电泳槽中，经过电场离子迁移，分离出不同长度的DNA片段。
4. 可视化和分析：通过染色或探针杂交等方法，对电泳结果进行可视化，并进行分析确定DNA片段的长度。
RFLP技术得以应用于诸多领域，具有以下几个主要的应用方面：1. 遗传病分析：RFLP技术可以用于检测导致遗传病的基因突变。
通过分析DNA序列中的限制性内切酶位点是否发生改变，可以确定个体是否携带突变基因，并判断其患病风险。
2. 亲子鉴定：利用RFLP技术可以对个体的DNA样本进行比对，确定亲子关系。
通过对父母和子女DNA样本的酶切和电泳分析，可以判断是否存在一致的DNA片段长度，从而确定亲子关系。
3. 种群遗传学研究：通过对不同个体的DNA样本进行RFLP 分析，可以判断不同个体之间的基因型差异，从而对种群内的遗传多样性进行研究，了解不同种群的遗传背景及遗传演化。
4. 进化与系统发生关系研究：RFLP技术可以用于研究不同物种或亚种之间的进化关系。
限制性片段长度多态性课件
在法医学中的应用
限制性片段长度多态性在法医学中发挥了重要作用，它可以帮助解决犯罪案件和 身份识别问题。
通过分析犯罪现场留下的DNA样本，限制性片段长度多态性分析可以提供有关嫌 疑人的遗传信息，有助于缩小嫌疑人范围或确认身份。此外，它还可以用于失踪 人员身份的鉴定和遗产纠纷等问题的解决。
限制性片段长度多态性的实验
限制性片段长度多态 性课件
目录
• 限制性片段长度多态性概述 • 限制性片段长度多态性的应用 • 限制性片段长度多态性的实验技术 • 限制性片段长度多态性与疾病关联
研究 • 限制性片段长度多态性的研究展望
01 限制性片段长度多态性概述
定义与特点
定义
限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一种基于限制性酶切和电泳技术检测DNA片段长度变异的方法。
环境因素与疾病关联研究
环境因素对疾病的发生和发展起着重 要作用。
RFLP技术可以用于研究环境因素与特 定RFLP位点的关联，有助于揭示环境 因素对疾病的影响和作用机制。
限制性片段长度多态性的研究
05
展望
新技术的应用
基因组学技术
随着基因组学技术的不断发展， 如全基因组关联分析、基因组测 序等，将有助于更深入地研究限 制性片段长度多态性的遗传机制
03
技术
酶切技术
01
限制性酶切
使用限制性酶对DNA进行切割，产生特定长度的DNA 片段。
02
酶切位点
限制性酶具有特定的识别和切割序列，从而产生具有特 定末端的DNA片段。
03
酶切效率
限制性酶的切割效率受多种因素影响，如DNA序列、酶 浓度和反应温度等。
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一根本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目的DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中别离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目的片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目的DAN，选择适宜的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
假如有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)别分开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上枯燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
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限制性片段长度多态性
(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)
一基本原理
各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).
二主要材料
DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)
图1
(一) 样本DNA制备
采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA
根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳
电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印
所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×
SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
该方法的优点是简单，不需要用其他仪器。
缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。
2电泳转移。
将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。
该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。
缺点是转移中电流较大,温度难以控制。
通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。
3真空转移。
有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。
该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。
转移后得到的杂交信号比盐桥法转移强2-3倍。
缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。
(五) 烤膜
去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2小时。
注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。
(六) 预杂交
将滤膜放入含预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。
在一定温度下(一般为37-42℃)预
杂交3-12小时，弃去预杂交液。
预杂交液中并不含有探针，该步的主要目的是减低背景，为杂交作准备。
(七) 探针的制备
探针是一种已知特异性的分子，它的制备首先需要获得所要的特异性的DNA片段。
然后再用放射性物质标记，如P32，a-PdNTPd等。
用这些物质标记虽然灵敏性高，效果好，但不安全。
另外，在试验中还常用地高辛标记，它没有半衰期且安全性好。
标记的方法常用缺口平移法、末端标记法、随机引物延伸法和反转录标记法。
该步骤必须保证探针的纯度以防止在杂交过程中出现杂带。
并且探针在杂交前也要使之变性。
(八) 杂交
在杂交液中加入探针,混匀。
如步骤（六）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。
(九) 洗膜
漂洗去非特异性结合的探针。
(十) 放射自显影和分析
空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X光片上曝光。
通常曝光1-2天后可见DNA谱带。
然后对谱带进行分析。
四RFLP的主要应用
(一) 遗传图谱和物理图谱的绘制。
所用的探针来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(mark),构建分子图谱。
当
某个性状(基因)与某个(些)分子协同分离时，表明这个性状(基因)与分子标记连锁。
分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记的距离，从而可将基因定位在分子图谱上。
(二) 系统发育分析
将不同物种的DNA分子进行杂交，可以通过构建系统进化树来确定物种之间亲缘关系的远近。
比如，在狐蝠亚科中，主要有两种食性的蝙蝠，即食花蜜狐蝠和食果实狐蝠，通过对这两种食性的物种进行RFLP分析和比较，构建两个物种的系统发育树，就可以确定食果实狐蝠是由食花蜜狐蝠进化而来。
(三) 基因诊断以及疾病基因的检测
在医学上，如果要检验病人的某基因是否发生癌变，可以先制备该基因在正常情况下的cDNA，然后把它与病人的这个基因进行杂交，即通过RFLP分析，就可以确定该基因是否发生癌变。
(四) 亲子鉴定和痕迹检验
在医学实践中，能准确进行亲子鉴定的是DNA检测，检测方法并非检测出全部碱基顺序，而是进行DNA杂交，即把所要检测的两人的卫星DNA进行杂交，再比较差异大小，从而说明两人的血缘关系，如父子、母女等。
另外，在公安机关的刑事侦察中，也常用DNA 杂交技术进行痕迹检验。
犯罪分子只要留下一丝一毫的身体细胞遗留物，如血液、皮屑、毛发等，技术人员就可以把犯罪嫌疑人的DNA 样本和现场发现的遗留物中提取的DNA样本通过DNA杂交，比较它们是否相同，从而确定现场留下的痕迹是否为犯罪嫌疑人的。
五对RFLP的评价
与其他的很多分子生物学技术相比，RFLP技术是比较完善和相对经典的。
例如，在植物中它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的。
另外，相对RAPD来说，它可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位还是由缺失、插入造成的。
然而，虽然RFLP有很多优点，但它也具有很多缺点，主要表现在以下几个方面。
(一) 操作比较烦琐和费时，实验周期较长。
(二) 通常只能检测那些已知的、改变限制性内切酶识别位点序列的DNA变异，而不利于搜索未知的DNA变异。
(三) RFLP方法检测变异时的拷贝灵敏度非常有限。
因此，在实际工作中，如果样本中可能存在多种DNA序列，而且其比例不是接近1∶1，很少使用RFLP方法来检验多态性。