限制性片段长度多态性 RFLP课件
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第二章基因组多态性
1. 小卫星DNA的特点 同一HVR的重复单位具有高度保守性。
在不同的个体或同一个体的同源染色体之间，重复单位的重复次数不同，构成 众多等位基因。
经酶切、电泳、变性、印迹、重复序列杂交、冲洗、显影后表现为丰富多彩的 RFLPs。
同一个体不同组织来源的RFLP谱带完全一样；而不同个体的谱带的位置和宽 度千差万别，可称为DNA指纹。
一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP ）
使用某种限制性内切酶酶切不同个体的DNA分子后，个体之间酶切片段长度的 差异性即限制性片段长度多态性。
限制性内切酶(restriction endonuclease) 酶主要分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、 连接酶 基因工程中常用的作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开 始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸
不同的个体或群体有不同的DNA 指纹图。英国遗传学家杰弗里斯对 白种人研究表明，两个随机个体具 有完全相同的DNA指纹图的概率 为3000亿分之一，两个同胞个体 具有相同图谱的概率也仅仅为200 万分之一。
2. 小卫星DNA与人类白细胞抗原多态性比较
HLA呈单倍型遗传
小卫星DNA非单倍型遗传 小卫星 DNA 的基因散在分布在多条染色体上，多对染色体的分离和自由组合，使得 同胞中也无相同的。
小卫星DNA的本质
由 一 些 约 十 多 个 或 几 十 个 bp 的 短 序 列 （ 即 重 复 单 位 ） 串 联 重 复 而 成 。 如 ： GGTTCTTAAAAAGGTTCTTAAAAA----GGTTCTTAAAAAGGTTCTTAAAAA 不 同 的个体或同一个体的两条同源染色体之间，重复次数可能并不相同。区别于存在 于着丝粒、端粒和Y长臂的重复序列，称为小卫星DNA。又称其为可变数目串联 重复序列（VNTR）。
形态学标记
1997 年9 月,大肠杆菌的完整基因图谱已 绘制成功, 基因组全序列完成, 全长为 5Mb ,共有4 288 个基因,同时也搞清了所 有基因产物的氨基酸序列.
啤酒酵母，1997年，第一个真核生物基 因组图谱公布。
秀丽线虫( caenorhabditis elegans) 1998 年12 月完成了基因组测序。基因组大小 100 Mb ,分布于6 条染色体,预测有19，099 个 基因。
分布广泛均匀 多态信息含量丰富 呈共显性遗传 稳定性好，可比性强 分析技术易于实现自动化 开发成本高
微卫星标记的应用领域
遗传图谱的构建 连锁分析特殊的基因（如致病基因） 姻亲分析样品鉴定（如父本分析、血缘分析、 等号样品分析、杂种分析） 物种和居群的遗传多样性 群体遗传学分析（如有效群体大小、群体遗传 结构、群体分化、迁移与基因流动） 保护生物学
(1) 小卫星 (minisatellite DNA)
小卫星重复单位的核心序列为15一76bp 近缘物种和个体间的小卫星核心序列有 着一定的同源性，在一定的条件下可以 相互杂交。
DNA指纹图谱原理
①选择在VNTR特异序列上没有酶切位点的限 制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度 的片段 ②以VNTR中特异序列作为探针，进行 Southern杂交， ③由于不同个体的串联重复序列的数目和位置 不同，形成的杂交谱带具有个体的特异性，人 们称为DNA指纹图谱 (DNA fingerprinting, DFP)
single nucleotide polymorphism 是指染色体上的某个存在单个碱基的变 化，包括单碱基的转换、颠换、插入及 缺失等。
T-RFLP
T-RFLP技术
桂林医学院生物技术学院
——程骏
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制 性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常 是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限 于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不 等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度 的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同 波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样 品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差 异。
下面是一张酶切不完全的电泳图
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序， 用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4 天能拿到，因此我的实验部分大约两周 能做一次。
五、图谱分析和数据分析
这是两个 同组样本 的图谱， 波峰大致 上是相同 的，这样 表明这两 个样本数 据是比较 可靠的。
总结
IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越 引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术 得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很 大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异 ，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。 由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于 具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的 结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质 地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。
桂林医学院生物技术学院
——程骏
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制 性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常 是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限 于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不 等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度 的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同 波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样 品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差 异。
下面是一张酶切不完全的电泳图
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序， 用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4 天能拿到，因此我的实验部分大约两周 能做一次。
五、图谱分析和数据分析
这是两个 同组样本 的图谱， 波峰大致 上是相同 的，这样 表明这两 个样本数 据是比较 可靠的。
总结
IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越 引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术 得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很 大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异 ，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。 由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于 具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的 结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质 地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。
特种医学课件-DNA长度多态性
20 ng
Unknown Samples ~2.5 ng
Calibration standards
0.63 ng
10 ng 5 ng
2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng
1.25 ng 2.5 ng 5 ng 10 ng 20 ng
琼脂糖凝胶电泳结合GoldView荧光燃料测定
11
12
三、DNA纯化
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人 发明了聚合酶链反应（PCR）, 基本原理是在试 管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一 过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的 应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus 公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。
1
DNA多态性分析技术
长度多态性
序列多态性
VNTR/小
STR/微卫
mtDNA
SNP
卫星DNA 星DNA
RFLP DNA指纹 Amp-FLP MVR-PCR
Amp-FLP/STR-PCR
DNA提取/纯化/ 定量，PCR及其 产物的检测
RFLP-PCR、ASO-PCR DHPLC、SSCP MALDI-TOF MVR-PCR、DNA Chip Sequencing，et al
[提取步骤] 溶血，然后加入NaOH ，80℃孵育10 min ，离心，保存上清液。
8
Chelex-100法：操作简单快速，检材用量少， 一管到底，样本DNA损失小，样本差错概率小； 不能用紫外法和凝胶电泳法定量 ，干扰抑制物未 去除。
酚/氯仿法：稳定，纯度高；繁复， 试剂毒性，检材用量大，样本DNA损 失多，样本差错概率大。
Unknown Samples ~2.5 ng
Calibration standards
0.63 ng
10 ng 5 ng
2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng
1.25 ng 2.5 ng 5 ng 10 ng 20 ng
琼脂糖凝胶电泳结合GoldView荧光燃料测定
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三、DNA纯化
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人 发明了聚合酶链反应（PCR）, 基本原理是在试 管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一 过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的 应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus 公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。
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DNA多态性分析技术
长度多态性
序列多态性
VNTR/小
STR/微卫
mtDNA
SNP
卫星DNA 星DNA
RFLP DNA指纹 Amp-FLP MVR-PCR
Amp-FLP/STR-PCR
DNA提取/纯化/ 定量，PCR及其 产物的检测
RFLP-PCR、ASO-PCR DHPLC、SSCP MALDI-TOF MVR-PCR、DNA Chip Sequencing，et al
[提取步骤] 溶血，然后加入NaOH ，80℃孵育10 min ，离心，保存上清液。
8
Chelex-100法：操作简单快速，检材用量少， 一管到底，样本DNA损失小，样本差错概率小； 不能用紫外法和凝胶电泳法定量 ，干扰抑制物未 去除。
酚/氯仿法：稳定，纯度高；繁复， 试剂毒性，检材用量大，样本DNA损 失多，样本差错概率大。
遗传多样性的分子检测PPT.
RAPD
局限性： ①它呈显性遗传标记（极少数共显性），不能有效区分杂合子 和纯合子。
②易受反应条件的影响，某些情况下，重复性较差，可靠性较 低，对反应的微小变化十分敏感。如聚合酶的来源，DNA不同 提取方法，Mg2+离子浓度等都需要严格控制。
扩增片段长度多态性（AFLP）标记
AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检 测DNA多态性的新方法。
根据依赖的技术手段的不同，DNA分子标记可分为3大类： ➢第一类是以杂交技术为基础的分子标记，如限制性片段长度多 态性（RFLP）标记、数目可变串联重复多态性（VNTR）标记； ➢第二类是基于PCR技术为基础的分子标记，如随机扩增多态性 DNA（RAPD）标记、任意RCP（AP-PCR）标记、DNA指纹 （DAF）标记、序列特征化扩增区域（SCAR）标记、扩增片段 长度多态性（AFLP）标记、简单重复序列（SSR）标记、内部 简单重复序列（ISSR）标记等； ➢第三类是基于测序和DAN芯片技术为基础的分子标记，如表达 序列标签（EST）标记和单核苷酸多态性（SNP）标记等。
理想的DNA分子标记应具备的特点 ①遗传多样性高 ②共显性遗传 ③在基因组中大量存在且分布均匀 ④表现为“中性”，对目标性状表达无不良影响，与不良性状无 必然连锁 ⑤稳定性、重现性高 ⑥信息量大，分析效率高 ⑦检测手段简单快捷，易于实现自动化 ⑧开发成本和使用成本低
限制性片段长度多态性（RFLP）标记
EST作用具体表现在： ① 用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱； ② 作为探针用于放射性杂交； ③ 用于定位克隆； ④ 借以寻找新的基因； ⑤ 作为分子标记； ⑥ 用于研究生物群体多态性； ⑦ 用于研究基因的功能； ⑧ 有助于药物的开发、品种的改良； ⑨ 促进基因芯片的发展等方面。
rflp原理
rflp原理RFLP原理。
RFLP（Restrition Fragment Length Polymorphism）是一种分子生物学技术，它是利用限制性内切酶切割DNA，通过分析DNA的特定序列长度差异来进行基因分型和遗传多态性研究的方法。
RFLP 技术在基因组学研究、疾病诊断和法医学鉴定等领域有着广泛的应用。
首先，RFLP技术的原理是基于DNA序列的差异性。
DNA序列中存在着许多的限制性内切酶切位点，当DNA经过限制性内切酶的切割作用后，会产生不同长度的DNA片段。
这些不同长度的DNA片段就构成了RFLP技术的研究对象。
而DNA序列的差异性来源于基因组中的多态性位点，即在不同个体中，同一位点上的DNA序列存在着不同的碱基组成，从而导致了限制性内切酶切割后的DNA片段长度差异。
其次，RFLP技术的步骤包括DNA提取、限制性内切酶切割、电泳分离和杂交探针检测。
首先是DNA提取，从样本中提取出待研究的DNA，然后通过限制性内切酶切割，将DNA切割成不同长度的片段。
接着是电泳分离，将切割后的DNA片段进行电泳分离，根据不同长度的片段在凝胶中的迁移速度来进行分离。
最后是杂交探针检测，将特定的DNA探针与目标DNA片段进行杂交，通过探针的特异性结合来检测目标DNA片段的存在与否。
再次，RFLP技术的应用非常广泛。
在基因组学研究中，RFLP技术可以用于构建遗传图谱、进行基因定位和克隆等研究。
在疾病诊断中，RFLP技术可以用于检测遗传病变和基因突变，对于一些遗传性疾病的诊断具有重要意义。
在法医学鉴定中，RFLP技术可以通过DNA指纹分析来进行个体识别和亲子鉴定，为司法鉴定提供了可靠的技术手段。
最后，RFLP技术虽然在过去曾经是基因分型和遗传多态性研究的主要方法，但随着PCR技术和基因芯片技术的发展，RFLP技术的应用逐渐减少。
然而，RFLP技术仍然具有一定的优势，例如在一些特定的基因分型和遗传多态性研究中，RFLP技术仍然是不可替代的。
RFLP,SNP标记
位于基因组内的SNP可以分为2种形式: 一是基因编码区的突变 ,主要分布于基因编码区 内(coding region) ,故又称其为cSNP; 二是遍布于基因组非编码区的大量单碱基变异 , 又分为基因周边SNP (peripheral SNP, pSNP) 及基因间SNP ( intronic SNP, iSNP) .研究表明 基因周边SNP频率比基因编码区SNP频率高。
SNP的检测方法分成四大类: （一）基因芯片技术 基因芯片技术 ：是在固相支持介质上进行分子杂交和原 位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。 （二）Taqman技术 在PCR反应系 统中加入2种不同荧光标记的探针，他们 分别与两个等位基因完全配对。探针运用 了荧光共振能量转换技术，探针的5’端 和3’端分别用特殊染料标记，称为供体受体染料对或爆-猝灭燃料对。
RFLP的应用
3.遗传多态性分析 运用RFLP技术可以尽 可能多地保存那些在已知位点上有异态的 品系，以求最大程度地保持品种的多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对DNA 序列自然变异的直接检测，只需选择 适 当的限制性内切酶或DNA探针作分子标 记，因而对植物不同种属或杂种后的的细 胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的 灵活性和灵敏性。因而能较好地应用于细 胞质遗传的研究。 ←
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。 2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
优点：（1）SNP具有共显性，能获得的 标记数量多，易于实现高通量。 （2）SNP是基因组中最简单、最常见的 多态性形式，具有很高的遗传稳定性。 缺点:芯片设计成本高，由于DNA样品的 复杂性，有些SNP不能被捡起。
研究生实验PCR检测apoB基因多态性ppt课件
（1.5%胶，100V, 1小时）
紫外灯下检测
（apoB基因PCR产物：双条带或单条带， 700bp左右）
8
9
10
1. 电泳前准备
准备内容
作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer
防止不必要的重复污染，减少外来 的污染。梳子干净有利于梳孔的形 成。
DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合， 在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
3
3
1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
• 1 DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； • 2 构象：共价闭环DNA分子>直线DNA>开环双链DNA； • 3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢； • 4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快； • 5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电板用量—— Plasmid:1ng, Chromosome:300-500 ng, 一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。
（2）可选DNA—— 质粒、 噬菌体、染色体DNA 注意： 防止交叉污染
28
4. dNTP
（1）四种脱氧核苷酸，基本原料,四种dNTP的浓度应相同， 其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺 入，降低合成速度，过早终止反应
4
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
5
2 实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6加样缓冲液 （溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium bromide）
紫外灯下检测
（apoB基因PCR产物：双条带或单条带， 700bp左右）
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1. 电泳前准备
准备内容
作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer
防止不必要的重复污染，减少外来 的污染。梳子干净有利于梳孔的形 成。
DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合， 在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
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1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
• 1 DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； • 2 构象：共价闭环DNA分子>直线DNA>开环双链DNA； • 3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢； • 4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快； • 5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电板用量—— Plasmid:1ng, Chromosome:300-500 ng, 一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。
（2）可选DNA—— 质粒、 噬菌体、染色体DNA 注意： 防止交叉污染
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4. dNTP
（1）四种脱氧核苷酸，基本原料,四种dNTP的浓度应相同， 其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺 入，降低合成速度，过早终止反应
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1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
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2 实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6加样缓冲液 （溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium bromide）