限制性片段长度多态性实验(RFLP)——【RT-PCR技术】
基因的序列分析 20131024
双脱氧核苷酸(ddNTP)
3’-5’磷酸 二酯键
不能与下一个脱氧 核苷酸结合!
（1）Sanger双脱氧末端终止法
背景知识
在PCR反应体系中，如果只加入一条引物是什么样子的结果？
• •
单引物只能扩增单链DNA 扩增的包含引物的单链DNA 不对称PCR (asymmetric PCR) 是用不等量的一对引物，PCR 扩增后产生大量的单链 DNA(SSDNA).
KRAS基因突变主要发生在密码子12，13上
密码子12/13发生变异的患者
应用 （举例说明： 应用焦磷酸测序法检测DNA甲基化）
焦磷酸测序法检测DNA甲基化
5’甲基胞嘧啶 在亚硫酸盐的作用下变成胸腺嘧啶
焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点 焦磷酸测序技术可检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平
将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固
相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程， 基本流程如下：
①制备待测 DNA 样品、标记基因探针；
②电泳分离待测DNA样品； ③待测DNA样品的变性、转膜；
④杂交；
⑤显色。
Southern 印迹杂交
Southern印迹基本操作过程
两种特殊底物 APS, 荧光素 四种酶： • DNA聚合酶 • ATP硫酸化酶• 荧光素酶
• 三磷酸腺苷双磷酸酶
（3）焦磷酸测序法
原理
DNA聚合酶
APS+
硫酸化酶 荧光素酶
双磷酸酶
荧光素+
（3）焦磷酸测序法
测序原理
第一步：加入测序引物，相关酶，底物，和其他试剂 第二步：每次加入一种dNTP,如果结合，则会产生一个焦磷 酸（PPi） 第三步：硫酸化酶转化PPI为ATP, ATP使荧光素酶发出荧 光。（产生的荧光强度与结合的核苷酸成正比） 第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环。 看一下视频
一、RFLP概念
▪ 可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射自显影显示
杂交信号。
▪ 也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记
特异核酸片段, 杂交信号经酶联显色或荧光显色得以
显示。
2、Southern印迹杂交
是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
▪ 一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的
▪ 1、靶D N A 的准备。先将基因组D N A 抽提出来, 选用合适的限制性核
酸内切酶酶解基因组D N A , 将酶解出来的具使其按片段的长短排列, 将D N A 片段变性后
转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上,称印迹(So u t he r n b l o t ) 转移, 并在8 0
▪ →利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果
分析。
1、RFLP 标记特点
优点:
▪ 无表型效应, RFLP 标记的检测不受性别、年龄的局限, 也不会因为表达
的组织、发育阶段或外界环境的不同而受影响;
▪ RFLP 标记座位的等位基因之间呈共显性, 因此通过电泳、杂交后的带
标记, 经纯化后再用。
▪ 3 、杂交显示。将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸
杂交, 洗膜去除未杂交的标记探针后, 进行放射自显影或加人酶的底物
进行显色反应, 再对显示出来的谱带进行分析。
1、染色体原位杂交
一种基于Southern 杂交的分子标记技术。它利用特异性
核酸片段作探针, 直接同染色体DNA 片段杂交, 在染色体
RFLP分子标记法
游良旺
胡才民
RFLP分子标记法
▪ 一、RFLP概念
▪ 二、RFLP 技术的基本原理
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
dna检测的方法及原理
dna检测的方法及原理DNA检测是一种现代生物学研究和应用的重要手段，广泛应用于疾病诊断、亲子鉴定、犯罪侦查等领域。
本文将介绍DNA检测的常见方法及其原理。
一、聚合酶链反应（PCR）法PCR法是最常用的DNA检测方法之一，它能够快速扩增DNA样品，从而达到检测目的。
PCR法的原理基于DNA的复制过程，通过逐渐升高和降低温度，DNA模板可以被酶（聚合酶）复制成数百万个几乎完全相同的片段。
这种方法具有高效、灵敏和高度特异性的特点。
二、电泳法电泳法是将DNA样品置于电场中进行分离和检测的一种常见方法。
它是基于DNA带电的特性，通过电子的运动来实现DNA的分离。
DNA电泳法可以用来检测DNA片段的大小、浓度和纯度。
常用的电泳方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
三、核酸杂交法核酸杂交法是通过DNA或RNA片段的互补配对现象来对目标DNA进行检测的方法。
该方法基于DNA的碱基互补性原理，引入与目标DNA序列互补的探针，通过离子效应的形成标记产物进行检测。
核酸杂交法在病毒检测、基因突变检测等方面具有重要的应用价值。
四、DNA测序技术DNA测序技术是对DNA进行精确测序的方法，被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断等领域。
其中，Sanger测序法是最早被使用的DNA测序方法之一，通过利用DNA合成中的dNTP链终止作用来确定DNA序列。
而近年来兴起的下一代测序技术（NGS）则具有高通量、高速度和低成本的优势，使得大规模DNA测序成为可能。
五、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法PCR-RFLP法是一种结合了PCR法和限制性片段长度多态性分析的方法。
它通过PCR扩增特定DNA片段，然后利用限制酶对扩增产物进行酶切，观察切割产物的大小差异，从而判断目标DNA片段是否发生了突变。
PCR-RFLP法在疾病相关基因突变检测和亲子鉴定等方面有广泛应用。
六、单核苷酸多态性（SNP）分析SNP分析是通过检测DNA中的单核苷酸变异（即SNP）来进行个体差异分析和细菌学鉴定的一种方法。
分子生物学实验 PCR-RFLP检测NQO1 C609T多态性ppt课件
PCR-RFLP
PCR (polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应
RFLP (restriction fragment length polymorphism) 限制性片段长度多态性
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序 列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
非同义SNPs 同义SNPs
调控区SNPs
单核苷酸多态性的常用分型技术
单链构象多态性、RFLP (restriction fragment length polymorphism，限制性片段长 度多态性)，变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、单碱基延 伸、高分辨率熔解曲线、DNA测序等，它们都是在对目的SNP扩增的基础上对PCR 产物进行分析。
PCR-RFLP检测NQO1 C609T多态性
【学习目的要求】
（一）掌握盐析法快速DNA抽提法的原理。 （二）掌握PCR-RFLP分型SNP的原理。 （三）熟悉盐析法快速DNA抽提法的操作技术。 （四）了解单核苷酸多态性的常用分型方法。
【实验教学内容】
（一）实验原理 （二）实验操作
（一）实验原理
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G
+ GATCC
CCTAG
G
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口：平端切口、粘端切口
HindⅡ GTCGAC CAGCTG
GTC
GAC
CAG + CTG
平端切口
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
分子诊断名词解释
分子诊断学：是临床检验诊断学的一个重要分支，它利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防和转归提供分子生物水平信息。
开放阅读框ORF：始于密码子并终于终止密码子的一串密码子组成的核苷酸序列。
密码子偏爱codon bias:在不同物种的基因中经常为某种氨基酸编码的只是其中的某一特定的密码子，这种现象叫做密码子偏爱。
基因组学genomics：对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能的一门科学。
C值矛盾：生物的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象。
基因组:细胞或非细胞生物体的一套完整的单倍体遗传物质的总和称为基因组（genome）基因(gene):是基因组中一个功能性遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列质粒:独立于细菌细胞染色体以外，能自主复制的共价闭合环状DNA（cccDNA）分子，称为质粒(plasmid)转化transformation:指受体菌直接吸收来自周围环境游离的DNA片段，通过同源组将其整合到自身的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。
转导transduction：以噬菌体为媒介把细菌的基因从一个细菌细胞转移到了另一个细菌细胞的过程。
分普遍性传导和局限性转导。
转座transposition:由插入序列和转座子介导的基因移位或重排成为转座。
外显子与内含子：断裂基因的内部非编码序列成为内含子intron,编码序列成为外显子exom 单拷贝基因：基因组中仅出现一次的基因称单拷贝基因，多为编码蛋白质的结构基因。
微卫星DNA：存在于常染色体由2~6个核苷酸的重复序列组成，又称为简单串联重复序列STR。
以(CA)n、(GT)n、(CAG)n较常见，重复次数多为15~60次，总长度一般在400bp以下。
假基因pseudogene:基因家族中一类与具正常功能的基因序列相似，但无转录功能或转录产物无功能的基因称为假基因。
rflp原理
rflp原理RFLP原理。
RFLP（Restrition Fragment Length Polymorphism）是一种分子生物学技术，它是利用限制性内切酶切割DNA，通过分析DNA的特定序列长度差异来进行基因分型和遗传多态性研究的方法。
RFLP 技术在基因组学研究、疾病诊断和法医学鉴定等领域有着广泛的应用。
首先，RFLP技术的原理是基于DNA序列的差异性。
DNA序列中存在着许多的限制性内切酶切位点，当DNA经过限制性内切酶的切割作用后，会产生不同长度的DNA片段。
这些不同长度的DNA片段就构成了RFLP技术的研究对象。
而DNA序列的差异性来源于基因组中的多态性位点，即在不同个体中，同一位点上的DNA序列存在着不同的碱基组成，从而导致了限制性内切酶切割后的DNA片段长度差异。
其次，RFLP技术的步骤包括DNA提取、限制性内切酶切割、电泳分离和杂交探针检测。
首先是DNA提取，从样本中提取出待研究的DNA，然后通过限制性内切酶切割，将DNA切割成不同长度的片段。
接着是电泳分离，将切割后的DNA片段进行电泳分离，根据不同长度的片段在凝胶中的迁移速度来进行分离。
最后是杂交探针检测，将特定的DNA探针与目标DNA片段进行杂交，通过探针的特异性结合来检测目标DNA片段的存在与否。
再次，RFLP技术的应用非常广泛。
在基因组学研究中，RFLP技术可以用于构建遗传图谱、进行基因定位和克隆等研究。
在疾病诊断中，RFLP技术可以用于检测遗传病变和基因突变，对于一些遗传性疾病的诊断具有重要意义。
在法医学鉴定中，RFLP技术可以通过DNA指纹分析来进行个体识别和亲子鉴定，为司法鉴定提供了可靠的技术手段。
最后，RFLP技术虽然在过去曾经是基因分型和遗传多态性研究的主要方法，但随着PCR技术和基因芯片技术的发展，RFLP技术的应用逐渐减少。
然而，RFLP技术仍然具有一定的优势，例如在一些特定的基因分型和遗传多态性研究中，RFLP技术仍然是不可替代的。
限制性片段长度多态性（RFLPS）及其原因
限制性片段长度多态性（RFLPS）及其原因
程罗根
【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】1994(000)003
【摘要】DNA是绝大多数生物(RNA病毒除外)携带和传递遗传信息的复杂的生物聚合体。
能被限制性核酸内切酶在特定的核苷酸顺序上切割,形成各种长度的DNA 片段,通过电源能将这些片段分开。
生物个体间的差异,本质上是DNA水平上的差异。
这是由于进化过程中染色体DNA上核苷酸顺序发生了改变,当这种改变涉及
到限制性酶切位点时。
【总页数】3页(P7-9)
【作者】程罗根
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q75
【相关文献】
1.限制性片段长度多态性（RFLP）与作物育种 [J], 朱乾浩
2.大豆品种间DNA限制性片段长度多态性(RFLP)的分析 [J], 张德水;庄炳昌
3.用IS2404限制性片段长度多态性（RFLP）分析不同地区的溃疡分支杆菌 [J],
无
4.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）
技术的优点 [J], 新展
5.水稻限制性片段长度多态性(RFLP)零等位现象的分子基础研究 [J], 毛龙;朱立煌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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实验六、限制性片段长度多态性
(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的
学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理
第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂
（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统
（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤
1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切
反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：
10xM buffer 1 μL
ddH2O 5.5 μL
Hind Ⅲ0.5 μL
PCR产物 3 μL
37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳
1
1 配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业
写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTT
TTCGA ↑A
AB
AA BB 2000 750 500
250
1000
100。