限制性片段长度多态性实验(RFLP)
RFLP技术
RFLP标记 标记
• 缺点： 缺点： • RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大， 且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依 赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP 分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高， 所以其应用受到了一定的限制。
RFLP标记 标记
• 优点： 优点： • 第一，较高可靠性，这是由限制性内切酶识别序列的专一 性决定； • 第二，来源于自然变异，依据DNA上丰富的碱基变异不需 任何诱变剂处理； • 第三，多样性，通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异， 因而在数量上无任何限制； • 第四，共显性，指RFLP能够区别杂合体与纯合体；
RFLP标记 标记
RFLP标记 标记
• 根据RFLP产生的原因, 可将RFLP分为三种类型： 单碱基突变型。 ①单碱基突变型。由于在限制性内切酶识别位点 上发生了单个碱基替换。从而使这一限制性位点 丢失或获得所产生的多态性，也称为点多态性。 结构重排型。 ②结构重排型。由DNA序列发生突变(包括缺失、 重复、易位和插人等,其中有些突变与转座子有关) 和近年发现的高变区(HVR)所引起, 其特征是限制 性内切酶识别位点本身的碱基未发生改变, 改变的 是它的相对位置。③甲基化类型发生改变 ③甲基化类型发生改变。如 Muller(1990)发现水稻再生植株中的一些(RFLP) 即由限制性位点的碱基甲基化类型发生改变所造 成
简单介绍RFLP分度的多样性（RFLP）是发展最早的分子标 记技术。是基于分子杂交技术的分子标记。 • 基本原理 基本原理：限制性内切酶识别双链DNA分子的特定序列, 并在特定位点将DNA切开, 形成长度不等的限制片段。不 同个体间DNA的核苷酸顺序变化就意味着各自DNA的特异 性切点分布不同, 从而经限制性内切酶酶解后产生不同的 限制片段。当这些大小不等的片段通过凝胶电泳时就形成 不同的带, 用分子探针杂交并利用放射自显影在感光底片 上成像, 就会找出不同的位置（如图1）。所以, RFLP指的 指的 是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后, 含同源序 是用限制性内切酶切割不同个体基因组 后 列的酶切片段在长度大小或数目上的差异。 列的酶切片段在长度大小或数目上的差异。
分子医学技能-生化：实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
• 本实验的预期目标：通过观察电泳条带的 差异，检测来自不同样本的apoB基因的多 态性.
apoB基因PCR产物鉴定
700 bp 600 bp
乙肝基因PCR产物鉴定
阳性 - + + -
对照
400 bp 300 bp
（2）个体疾病的预防：易感基因 （3）个体化用药的指导：药物代谢酶等 （4）个体身份的验证：识别个体、亲子
鉴定等
Apo B
• 载脂蛋白B基因位于2号染色体断臂末端，全长 43Kb；
• DNA 3’端181bp构成一种由11-16bp重复排列的超 变异小卫星序列，分布在500-800bp之间；
• ApoB是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要 结构蛋白 ,血液中ApoB的测定值可直接反映LDL的 含量 .
实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
实验内容
• 1、乙肝病毒基因PCR、apoB基因PCR（已完 成）；
• 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；
• 3、鉴定乙肝病毒基因PCR产物的DNA凝胶电 泳：1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，30min；
一、DNA琼脂糖凝胶电泳
• 导致血浆胆固醇升高的基因突变 ：
– ApoB基因遗传变异可合成有缺损的ApoB蛋白质， 后者与LDL受体亲和力下降，引起LDL清除障碍， LDL在血浆中蓄积。
– apoB DNA多态性或遗传变异与高胆固醇血症、 动脉粥样硬化、心肌梗赛、冠心病以及肥胖之 间密切相关；
• 导致血浆胆固醇水平降低的基因突变 :
单条带，700bp左右）
，315bp）
1. 电泳前准备
准备内容
基因工程选择题
1.限制性内切酶一般保存在（50%）浓度的甘油溶液中。
?2.限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最显着区别在于（?A?）?3.?A.?前者是物理图谱后者是连锁图??4.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C）????? C.?只能作用于双链?DNA??5.已知某一内切酶在一个环状?DNA?上有?4?个切点，当用此酶切割该环状?DNA?，可以得到（?4?）个片段??6.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（5%?）以下????7.在下列进行?DNA?部分酶切的条件中，控制哪一项最好（?D?）?D.酶量???8.DNA?被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C??）??A.?蛋白质（如?BSA）同?DNA?结合 B.有外切核酸酶污染? C.酶失活? D.酶切条件不适合???8.nick切口?与?gap?缺口的区别在于（A??）???A.前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指?DNA?的单链中有较小的缺失??9.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。
命名时（?A?）??A.属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）10.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（?A?）???A.识别相同序列的限制酶称同裂酶? B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶??C.同裂酶的切割位点一定相同?D.同裂酶的切割位点不相同????11.下列哪一种酶作用时需要引物（B??）??A.?末端转移酶?B.反转录酶?C.DNA?连接酶?D.限制酶???12.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（?C?）不恰当??A.由作用于同一?DNA?序列的两种酶构成??B.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对?DNA?进行修饰??C.不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统??D.这一系统的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶????13.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（C.双链?DNA?的特定碱基序列??）????14.在大肠杆菌中，大多数都有三个位点特异性的?DNA?甲基化酶，以下选项中哪一种酶不包括在内??（D??）A.?dam??B.?dcm（）?C.?EcoKⅠ?D.?SssⅠ???15.在大肠杆菌中，至少有?3?种依赖于甲基化的限制系统，以下选项中不属于这?3?种的为（?C?）??A.??mcrA? ?B.?mcrBCC.??mcrD? ?D.??mrr?????16.下面有关限制酶的叙述哪个是错误的（??A）??A..?限制酶是外切酶而不是内切酶??B.?同一种限制酶切割?DNA?时留下的末端序列总是相同的??C.?一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链?DNA?，产生粘末端??D.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链?DNA?，产生平末端????17.DNA?连接酶在体内的主要作用是在?DNA?复制、修复中封闭缺口，下列对?DNA?连接酶的描述中，哪项是正确的（??A）??A.?将双链?DNA?分子中的?5'?磷酸基团同?3'－OH?末端重新形成磷酸二酯键??B.作用时不消耗能量C.?需要?Mn2+?等二价辅助离子D.也可以连接?RNA?分子???1.氨苄青霉素的工作原理为（A?）??A.?可以抑制细胞壁肽聚糖的合成3.载体所具备的特点中，以下描述不恰当的是（B??）??A.?必须具备复制起点，能够自主复制?? B.必须具备合适的酶切位点，供外源?DNA?片段插入??C.有一定的筛选标记，用于筛选??D.?必须具有较高的拷贝数，便于制备???4.复制子由三部分组成，以下不属于的为（?D?）??（）?A.?复制起点? B.?复制区? C.?复制终点? D.启动子???5.pBluescript?M13?载体在多克隆位点的两侧引入了?T7?和?T3?两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，以下?4?种功能哪一种是不正确的（D）??A.?可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析?? B.?利用这两个启动子的通用引物进行?PCR?扩增??C.?利用通用引物进行序列分析?? D.利用这两个启动子进行定点突变???6.以粘粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会出现大小不一、生长速度不一的现象，其原因是（??D）??A.?营养成分不足B.重组后的质粒复制不稳定?C.?重组后的粘粒整合到宿主染色体上?D.?重组体中插入片段的大小不同????7.噬菌粒是由质粒和噬菌体?DNA?共同构成的，其中来自质粒的主要结构是（），而来自噬菌体的主要结构是（?A）?? ?A.复制区；?B.?IG?区?IG?区；C.?复制区?多克隆位点；?D.?IG?区?IG?区；多克隆位点?????9.M13?单链噬菌体的复制分为三个阶段，以下哪一项不属于此（D）??A.?SS→RF B.?RF→RF? C.?RF→SS ?D.?SS→SS???10.λ?噬菌体?DNA?和?M13?单链噬菌体?DNA?在成熟前的?DNA?复制类型为（?A?）??A.?滚环复制模型?12.以下对粘粒为载体的重组体的描述正确的是（?B?）??B.?各重组体在平板上生长的速度不同，转化子中插入片段的扩增量也是不同的?13.下列哪种克隆载体对外源?DNA?的装载量最大（?酵母人工染色体（YAC）14.同一种质粒?DNA?，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是（?B?）??B.?SC? DNA > L ?DNA > OC DNA??15.关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确（??A）???A.?在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点?16.反向重复序列：（可以回折形成发夹结构17.λ?噬菌体线性?DNA?分子的两端各有一个（?12??）个碱基组成的天然黏性末端?????18.下列关于细菌人工染色体（BAC）的特点描述，除（?B?）以外都是正确的??A.?BAC?载体在细菌中以环状超螺旋状态存在，使分离操作比?YAC?容易??B.?BAC?载体在大肠杆菌中为高拷贝?C.用电击法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了?10～100?倍??D.克隆在载体上的外源片段可以直接进行末端测序???19.粘粒（cosmid）是一种人工建造的载体，下列对它的描述中哪一项是不正确的（D）?A.?它具有?cos?位点，因而可以进行体外包装?B.它具有质粒?DNA?的复制特性?C.?进入受体细胞后，可引起裂解反应?D.?进入受体细胞后，可引起溶源化反应??20.松弛型质粒：（?A?）?? A.?在寄主细胞中拷贝数较多21.关于质粒的不相容性，下列哪一种说法正确（C??）???C.?如果两个质粒不相容，说明它们的复制机制相同22.一般情况下，质粒的存在情况以下描述正确的是（??A）??A.?独立存在24.下列哪一项不是质粒载体必备的基本特征（?D?）???A.?可以独立复制? B.?有选择标记? C.?有多克隆位点? D.含?lacZ????28.下面关于松弛型质粒的性质描述中，（?A?）是不正确的??A.?通常带有抗性标记 B.可以使用氯霉素作用增加拷贝数??C.同严谨型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子??D.质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数?????30.以下不是表达载体所必须的条件是（C??）??A.?必须具备很强的启动子?? B?必须具备很强的终止子?B.?C.?启动子不需要受控制?D.?所产生的?mRNA?必须具有翻译的起始信号???1.用?SDS－酚抽提?DNA?时，?SDS?浓度十分重要，?0.1%?和?1%?的?SDS?的作用分别为（?B?）?B.?前者?0.1%只能将?RNA?分离出来；后者1%?能将?DNA?和?RNA?一起分离出来????2.从细胞或组织中分离?DNA?时蔗糖的作用（C??）?C.?保护?DNA?，防止断裂??3.－70℃保存?DNA?是最好的?4.在分离?DNA?过程造成?DNA?分子断裂的因素很多，下列说法中哪一项是不正确的（?C?）???A.?核酸酶的降解? B.?化学降解? C.?保存液中未加一滴氯仿?D.?物理剪切?????5.关于?cDNA?的最正确的说法是（?A?）??A.?以?mRNA?为模板合成的双链?DNA6.一个典型的哺乳动物细胞中，大部分的?RNA?为?C.?rRNA7.Agarose-EB?电泳法分离纯化?cccDNA?的原理是（?B?）??B.?EB?不容易插入到?cccDNA?中，因而迁移速度快8.下列哪一项不是?Southern?blotting?的步骤（B??）?A.?用限制酶消化?DNA B.?DNA?与载体的连接??C.?凝胶电泳分离?DNA?片段D.?DNA?片段转移到硝酸纤维膜上???9.Southern?blotting?的?DNA?探针（?D?）???D.?可与任何含有互补序列的?DNA?片段????杂交10.以下（?D.?Western?blotting????）方法才能说明外源基因进行了表达??11.斑点杂交的缺点在于（?D?）?? ?D.?假阳性较高?????12.菌落杂交筛选重组体时，（B??）?? B.?不需要外源基因的表达??13.Southern?blotting?与?Northern?blotting?的区别在于（A??）??A.?印记的对象不同，前者Southern?blotting?是对?DNA?，后者Northern?blotting是对?RNA??14.以下不属于核酸探针的是（D）??A.?RNA?探针?B.?基因组探针?C.?cDNA?探针?D.?抗体???1.聚合酶链式反应可表示为（?D?）??D.?PCR???2.催化聚合酶链式反应的酶是（?D?）?? D.?Taq?DNA?聚合酶???3.以下各项中不是?PCR?反应所必须的是（D??）??A.?模板和引物?B.?dNTP??C.?Taq?酶和?bufferD.?甘油???4.关于?PCR?技术的叙述，下列哪项是错误的？（?B?）。
基因多态性的检测方法
基因多态性的检测方法一、直接方法1.目标基因测序：通过对目标基因进行测序，可以直接得到其等位基因的序列信息。
目前，高通量测序技术的发展使得测序成为一种常用的基因多态性检测方法。
2.杂交技术：杂交技术可以用于检测单核苷酸多态性（SNP）和小片段插入/缺失等变异。
常用的方法包括限制性片段长度多态性（RFLP）和串联重复片段多态性（VNTR）等。
3.聚合酶链反应（PCR）：PCR可以通过扩增目标片段的方法，检测基因多态性。
例如，引物在目标序列上的配对使得PCR扩增产物的长度与目标基因的等位基因有关。
通过测定扩增产物的长度变化，可以确定基因多态性。
4.克隆测序：克隆测序是一种将目标基因克隆到载体中，并对克隆的DNA进行测序的方法。
这种技术可以用于检测较大的插入/缺失变异以及基因拷贝数变异等。
二、间接方法1.单核苷酸多态性（SNP）芯片：SNP芯片是一种高通量并行检测SNP 的技术。
它通过固定在芯片上的特异性探针与待测样品中的SNP位点进行杂交，然后使用荧光信号检测方法来确定不同等位基因的存在情况。
2.DNA芯片：DNA芯片可以广泛用于基因多态性的检测。
它可以同时测定数百甚至数千个基因，快速、准确地检测多个等位基因的存在情况。
3.高分辨率融解曲线分析：高分辨率融解曲线分析可以用来区分等位基因之间的序列差异。
该方法通过双链DNA在升温过程中解旋变性的温度差异，来分析目标序列中的等位基因。
4. 二代测序技术：二代测序技术（如Illumina和Ion Torrent）基于多组重叠的小片段测序，可以用于高通量的基因多态性检测。
它可以同时测定数百万个SNP位点，识别多个等位基因的存在情况。
综上所述，基因多态性的检测方法涵盖了直接方法和间接方法。
这些方法可以用于检测单核苷酸多态性、插入/缺失变异、基因拷贝数变异等不同类型的基因多态性。
随着技术的不断发展，基因多态性的检测方法将变得更加高效、准确和经济。
末端限制性片段长度多态性技术_T_省略_微生物群体分析上的应用与技术优化_李献梅
中国农业大学学报 2009,14(4):1-9Journal o f China A g ricultur al U niv ersity末端限制性片段长度多态性技术(T -RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化李献梅 王小芬 崔宗均*(中国农业大学农学与生物技术学院/中国农业大学生物质工程中心,北京100193)摘 要 末端限制性片段长度多态性技术(T-RFL P)是以荧光标记引物P CR 为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。
本文综述了该方法在群体微生物分析上的应用及DN A 提取、PCR 扩增、酶切和数据分析等步骤的技巧与优化,总结了科学应用该技术的要求以及和多重PCR 、gy r B 基因等相结合的观点。
关键词 T -RF LP ;微生物群体;图谱分析;PCR;克隆中图分类号 Q 936 文章编号 1007-4333(2009)04-0001-09 文献标志码 A收稿日期:2008-10-27基金项目:国家/十一五0科技支撑计划(2006BAD07A 01;2006BA D25B04)第一作者:李献梅,博士研究生,E -mail:staro fchina@g 通讯作者:崔宗均,教授,主要从事生物质资源利用与微生物生态研究,E -mail:acuizj@Applications and optimizations of T -RFLP in fingerprintingenvironm ental microbial populationsLI Xian -mei,WANG Xiao -fen ,CUI Zong -jun *(College of Agronomy and Biotechnology/Center of Biomas s Engineeri ng,Chi na Agricul tural U nivers i ty,Bei jing,100193,China)Abstract Terminal re stric tio n fra gment leng th polymorphis m (T -RFLP)is one o f micro bia l popula tio n fing erprinting me tho ds tha t is ba sed o n labele d primers -PCR to ide ntify microbial co mposition a ccording to diffe re nt terminal re stric tio n frag me nt leng ths.The applic ations and te chnica l o ptimizations we re o ve rv iew ed o f T -RFLP thro ugh the pro cedures of DNA preparation,PCR,enzyme dig estion and da ta analysis.The sc ientific applic ation re quire me nts and new view s of combination with multiple -PCR o r g yr B g e ne we re dra wn.Key words T -RFLP;microbial po pulation;fing erprinting ana lysis;PCR;clone libra ry当前环境微生物组成及生态研究已经成为微生物领域的一大热点[1]。
dna检测的方法及原理
dna检测的方法及原理DNA检测是一种现代生物学研究和应用的重要手段，广泛应用于疾病诊断、亲子鉴定、犯罪侦查等领域。
本文将介绍DNA检测的常见方法及其原理。
一、聚合酶链反应（PCR）法PCR法是最常用的DNA检测方法之一，它能够快速扩增DNA样品，从而达到检测目的。
PCR法的原理基于DNA的复制过程，通过逐渐升高和降低温度，DNA模板可以被酶（聚合酶）复制成数百万个几乎完全相同的片段。
这种方法具有高效、灵敏和高度特异性的特点。
二、电泳法电泳法是将DNA样品置于电场中进行分离和检测的一种常见方法。
它是基于DNA带电的特性，通过电子的运动来实现DNA的分离。
DNA电泳法可以用来检测DNA片段的大小、浓度和纯度。
常用的电泳方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
三、核酸杂交法核酸杂交法是通过DNA或RNA片段的互补配对现象来对目标DNA进行检测的方法。
该方法基于DNA的碱基互补性原理，引入与目标DNA序列互补的探针，通过离子效应的形成标记产物进行检测。
核酸杂交法在病毒检测、基因突变检测等方面具有重要的应用价值。
四、DNA测序技术DNA测序技术是对DNA进行精确测序的方法，被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断等领域。
其中，Sanger测序法是最早被使用的DNA测序方法之一，通过利用DNA合成中的dNTP链终止作用来确定DNA序列。
而近年来兴起的下一代测序技术（NGS）则具有高通量、高速度和低成本的优势，使得大规模DNA测序成为可能。
五、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法PCR-RFLP法是一种结合了PCR法和限制性片段长度多态性分析的方法。
它通过PCR扩增特定DNA片段，然后利用限制酶对扩增产物进行酶切，观察切割产物的大小差异，从而判断目标DNA片段是否发生了突变。
PCR-RFLP法在疾病相关基因突变检测和亲子鉴定等方面有广泛应用。
六、单核苷酸多态性（SNP）分析SNP分析是通过检测DNA中的单核苷酸变异（即SNP）来进行个体差异分析和细菌学鉴定的一种方法。
基因组学 基因组多态性
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1. 小卫星DNA（minisatellite DNA）
……[GCTACGTATCGGTACTGAACG]n……
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分子遗传标记ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ种类
➢ 限制性片段长度多态性（RFLP） ➢ 小卫星DNA (minisatellite DNA) ➢ 微卫星DNA （microsatellite DNA） ➢ 单核苷酸多态性（SNPs) ➢ 表达序列标签(EST）和序列标签位点（STS） ➢ 表观遗传修饰（epigenetic modification)
（3）DNA指纹在生物学中的应用
DNA Fingerprints from a Murder Case
DNA指纹的应用
（1）法医学方面——个体识别
现场检材和嫌疑对象的DNA指纹 条带位置与强度一致，则为同一 个体。
（2）亲子鉴定
如能从父母指纹中找到孩子的所 有条带，亲子关系成立。
（3）DNA指纹在生物学中的应用
➢ 是一类能够稳定遗传的物质，同时通过一定的方法可以检测其客观存在 （识别），用以区分不同的个体和群体（鉴定），或者能够区分不同的染 色体位点。
➢ 常用于基因的连锁分析、基因定位、遗传作图和基因转移的鉴定等
13
遗传标记的发展
遗传标记的内涵是随着遗传学，特别是基因概念的发展 而发展的
常见的遗传标记有：
例如，用α珠蛋白3’HVR核心序列探针所显示的DNA指纹，个体相同 机率为4×10-12，意味着现今世界上除同卵双生外没有DNA指纹相同 的人。
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
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实验限制性片段长度多态性
(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的
学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理
第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂
（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统
（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤
1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切
反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：
10xM buffer 1 μL
ddH2O 5.5 μL
Hind Ⅲ0.5 μL
PCR产物 3 μL
37℃水浴消化2h ，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业
写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTT
TTCGA ↑A AB
AA BB 2000 750
500
250
1000
100。