高中生物论文解读限制性核酸内切酶应用的考点例析人教版
限制性内切酶考点小结
限制性内切酶考点盘查限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。
1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
化学本质为蛋白质。
②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。
③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。
④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。
如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。
2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。
②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。
③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。
2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。
如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。
切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。
②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。
③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。
2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。
如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。
一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。
不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用
5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低
应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
限制性内切酶应用.pptx
II型限制性内切酶的分类（一）
❖
内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和
Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类
酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都
以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的
是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到
DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的
位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。 通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降 解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可 相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶 来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完 全反应。
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开
DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们
识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门
切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到
DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此
序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。
当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的
功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
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一些概念
❖粘末端和平末端 ❖同尾酶 ❖同裂酶 ❖同识异切酶 ❖消化 ❖星号活力
第12页/共43页
同裂酶和同尾酶：
同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
段丢失了可被Mst II或CvnⅠ切开的一个限
制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制 性酶切的结果，用Southern blot分析方法 和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析 方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前 诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分 析。
高中生物解读《限制性核酸内切酶应用的考点例析》人教版
解读《限制性核酸内切酶应用的考点例析》我们知道限制性核酸内切酶（限制酶）是指能识别DNA中特定碱基顺序，并在特定位点切割双链DNA的核酸内切酶。
它在生物学中应用相当广泛，是基因工程中的工具酶，用来构建重组DNA分子，对于遗传性疾病的基因定位和基因诊断的研究也具有重要的应用价值。
下面我们以问题的形式简要地了解它在这些方面的应用。
1。
限制酶的特点例1．下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATCCTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAG解析：限制酶识别的各种序具有回文对称的特点。
所谓回文对称序列就是当以不同的方向分别阅读DNA的两条互补链时，DNA的两条链上的碱基序列相同。
如A中的DNA分子，其中一条链从左向右阅读碱基序列是GAATTC，另一条互补链从右向左阅读碱基序列也是GAATTC。
答案：D例2．限制酶HindⅢ酶切DNA的识别序列是AAGCTT，限制酶HpaⅡ酶切DNA的识别序列是CCGG。
假定DNA分子中A、T、G、C所含的比例相等，那么，限制酶HindⅢ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb（千碱基）；限制酶HpaⅡ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb。
解析：因为限制酶识别序列具有回文对称序列的特点，这两个序列在相应的互补链上又会呈现，因此我们只需考虑DNA的一条链即可。
六碱基长HindⅢ识别序列AAGCTT出现的概率是（1/4）6或1/4096，因此HindⅢ酶切位点之间的平均距离大约为4 kb。
同样的道理，4碱基长的HpaⅡ酶识别序列CCGG出现的概率是（1/4）4或1/256，因此HpaⅡ酶切位点的平均距离大约为kb。
2．黏性末端与限制酶类型的关系例3．用同一种限制酶处理会产生相同的黏性末端，但用不同的限制酶处理也可能产生相同的黏性末端。
下列所示的四个黏性末端是由（）种限制酶作用产生的。
2019新人教版高中生物选择性必修三第三章重点知识点归纳总结(基因工程)
第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
（1）EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键（2）Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
限制性内切酶 (1)解析
定义和命名
DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸 酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这 样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例 如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性 内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基 顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、 HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制 与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近 切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 46bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或 简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似 的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ， 切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相 反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两 个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成， 分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的 一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）， 如 N.Bst NBI 。
简析限制性内切酶
简析限制性内切酶限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。
基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。
1限制酶的作用及影响因素1.1 作用：切割特定的核苷酸序列[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。
现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A.3B.4C.9D. 12【答案】C【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。
若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。
因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。
1.2 作用结果：形成DNA片段末端黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。
平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。
以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。
请根据以下图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。
表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。
请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。
人教版高中生物必修二第六章第2节《基因工程及其应用》 课件 (共39张PPT)
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基因工程
一、基因工程的基本工具
（1）基因的“剪刀”：限制性核酸内切酶
↓ 限制酶
GA A T T C
CT T A A G
↓
一、基因工程的基本工具
（1）基因的“剪刀”：限制性核酸内切酶
↓ 限制酶
GA A T T C
CT T A A G 切割磷酸二酯键
↓
一、基因工程的基本工具
（1）基因的“剪刀”：限制性核酸内切酶
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17、儿童是中心，教育的措施便围绕他们而组织起来。上午4时35分33秒上午4时35分04:35:3321.8.25
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解读《限制性核酸内切酶应用的考点例析》
我们知道限制性核酸内切酶（限制酶）是指能识别DNA中特定碱基顺序，并在特定位点切割双链DNA的核酸内切酶。
它在生物学中应用相当广泛，是基因工程中的工具酶，用来构建重组DNA分子，对于遗传性疾病的基因定位和基因诊断的研究也具有重要的应用价值。
下面我们以问题的形式简要地了解它在这些方面的应用。
1。
限制酶的特点
例1．下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）
A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATC CTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAG
解析：限制酶识别的各种序具有回文对称的特点。
所谓回文对称序列就是当以不同的方向分别阅读DNA的两条互补链时，DNA的两条链上的碱基序列相同。
如A中的DNA分子，其中一条链从左向右阅读碱基序列是GAA TTC，另一条互补链从右向左阅读碱基序列也是GAATTC。
答案：D
例2．限制酶HindⅢ酶切DNA的识别序列是AAGCTT，限制酶HpaⅡ酶切DNA的识别序列是CCGG。
假定DNA分子中A、T、G、C所含的比例相等，那么，限制酶HindⅢ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb（千碱基）；限制酶HpaⅡ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb。
解析：因为限制酶识别序列具有回文对称序列的特点，这两个序列在相应的互补链上又会呈现，因此我们只需考虑DNA的一条链即可。
六碱基长HindⅢ识别序列AAGCTT出现的概率是（1/4）6或1/4096，因此HindⅢ酶切位点之间的平均距离大约为4 kb。
同样的道理，4碱基长的HpaⅡ酶识别序列CCGG出现的概率是（1/4）4或1/256，因此HpaⅡ酶切位点的平均距离大约为0.25 kb。
2．黏性末端与限制酶类型的关系
例3．用同一种限制酶处理会产生相同的黏性末端，但用不同的限制酶处理也可能产生相同的黏性末端。
下列所示的四个黏性末端是由（）种限制酶作用产生的。
解析：不同的限制酶的识别序列和切割位点不同。
要判断题中的4个黏性末端是由几种限制酶作用下产生的，不光要看共有几种黏性末端，更重要的是要看作用产生这些黏性末端的限制酶的识别序列和切割位点是否相同。
经过分析，题中4幅图所示的黏性末端应该分别是由4种限制酶作用产生的，这4种酶的识别序列及切割位点依次是：G↓AATTC，C↓AA TTG，G↓TTAAC，C↓TTAAG。
答案：4
3．限制酶图谱分析
例4．一线性DNA分子分别用限制酶HindⅢ和SmaⅠ消化，然后用这两种酶混合消化，得到如下片段：
HindⅢ 2.5 kb，5.0 kb
SmaⅠ 2.0 kb，5.5 kb
HindⅢ和SmaⅠ 2.5 kb，3.0 kb，2.0 kb
（1）画出此丝性DNA分子的限制酶图谱。
（2）两酶混合消化的片段再用限制酶EcoRⅠ消化，结果导致凝胶上3.0 kb的片段消失，产
生一个1.5 kb的新片段。
请标出限制酶EcoRⅠ在限制酶图谱上的切割位点。
解析：（1）用限制酶HindⅢ消化DNA得到2.5 kb与5.0 kb两个片段，如果加入双酶HindⅢ和SmaⅠ得到2.5 kb，3.0 kb，2.0 kb三个片段，这说明限制酶SmaⅠ能将HindⅢ消化DNA得到5.0 kb片段切割为3.0 kb和2.0 kb片段。
据此，可画出如下限制酶图谱。
（2）因为只有3.0 kb的片段消失，并且生成一个新的1.5 kb的片段，表明此片段有一个EcoRⅠ酶切位点，且位于此片段的中央。
3.0 kb的片段被限制酶EcoRⅠ切成2个等长1.5 kb的片段，在凝胶上显示出一个1.5 kb的新片段。
例4．今用PCR方法扩增了一2kb的DNA片段，纯化后用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ单独消化，然后混合消化，凝胶电泳分离，结果如下。
EcoRⅠ150bp，500 bp，1250 bp，100 bp
HindⅢ350 bp，650 bp，1000 bp
EcoRⅠ和HindⅢ100bp ，150 bp ，200bp，300bp，350bp，900 bp
根据以上数据，构建此DNA片段的限制酶图谱。
解析：双酶消化表明，1250 bpEcoRⅠ酶切片段中含有一个HindⅢ酶切位点（产生350bp 和900 bp两个片段），500bpEcoRⅠ酶切片段含有一个HindⅢ酶切位点（产生200kbp和300bp 两个片段）；350bp，650bp和1000bpHindⅢ酶切片段各有一个EcoRⅠ酶切位点。
根据以上分析，可画出如下限制酶图谱。
4．基因诊断
例6．一对等位基因经某种限制酶切割后形成的DNA片段长度存在差异，凝胶电泳分离限制酶切割的DNA片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱（如图Ⅰ所示）。
根据该特性，就能将它作为标记定位在基因组的某一位置上。
现有一对夫妇生了四个儿女，其中1号性状表现特殊（如图Ⅱ）。
由此可推知四个女儿的基因型（用D、d表示一对等位基因）正确的是（）
A．1号为X d X d者B．2号为X D Y C．3号为Dd D．4号为DD或Dd
解析：不含有特殊性状的双亲生出性状表现特殊的1，且为女性，由此可见该特殊性状是隐性的，并位于常染色体上，1号为dd，双亲均为Dd。
从给出的“带谱”显示可知，杂合体显示的DNA片段是一长一短（长/短）的，而纯合体是两长（长/长）或两短（短/短）。
1是隐性纯合显示为短，则显性显示的带谱为长。
双亲为杂合子（Dd），其等位基因限制酶切后，凝胶电泳分离与探针杂交显示两条不同长度DNA片段（长/短）的带谱。
其“杂合性片段”完全像基因一样，呈孟德尔式遗传。
可写为：
亲本：长/短×长/短
↓
子女：1/4长/长2/4长/短1/4短/短
结合后代带谱的显示可判断：子女中1号为短/短（dd），2号为长/长（DD），3号为长/短（Dd），4号为长/长（DD）。
答案：C。