各类层析色谱分析技术完全讲解
色谱分析技术 ppt课件
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填充柱色谱法 GC 毛细管柱色谱法
色谱法
高效液相色谱法 柱色谱 经典液相色谱法
LC 薄层色谱法
平面色谱法 纸色谱
吸附柱色谱 分配柱色谱 离子交换色谱 凝胶色谱
CE 毛细管电泳色谱法
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三、色谱过程
2、点样
（1）样品溶液的制备： 怎样选择溶剂？ 水可以用吗？
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2、点样
（2）点样量： 与薄层板的关系 太多太少的影响
点样基线：距底边2.0cm 样点直径：2-4mm 点间距离：1.5-2.0cm
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2、点样
（3）点样方法： 划线、样品记号点、点样
注：动作要轻， 毛细管或点样器不能混用， 斑点大小适当，可多次点样。
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（二）杂质检查（杂质限量检查）
2、自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）
样品溶液稀释制成一定浓度的溶液 样品制成一定浓度溶液
按相同的点样量点样
展开后观察斑点颜色深浅和大小
如地西泮中有关物质的检查： 取本品的细粉适量（约相当于地西泮200mg），加丙酮5ml,振
摇，使地西泮溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液；精密量取适量， 加丙酮稀释成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作为对照溶液。点 样展开后，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较， 不得更深。
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四、结果计算和判断 （一）定性鉴别
判断依据：Rf值、Rs值 1、查找资料：影响Rf值的因素
吸附剂种类、活度、颗粒大小；展开剂纯度和极性； 薄层厚度；点样量；展开方式、温湿度；展开槽中的预饱 和状态等。 2、对照品比较法：常用。
层析色谱
色谱层析色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。
文字在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。
色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
【色谱理论】保留时间的理论保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。
保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：tR = t0(1 + KVs / Vm)式中tR表示某物质的保留时间，t0是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。
K为分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。
这个公式又叫做色谱过程方程，是色谱学最基本的公式之一。
在薄层色谱中没有样品进入和流出固定相的过程，因此人们用比移值标示物质的色谱行为。
比移值是一个与保留时间相对应的概念，它是样品点在色谱过程中移动的距离与流动相前沿移动距离的比值。
与保留时间一样，比移值也由物质在色谱中的分配系数决定：R_f=\frac{V_m+KV_s}其中Rf是比移值，K表示色谱分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。
基于热力学的塔板理论塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。
一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。
根据塔板理论，待分离组分流出色谱柱时的浓度沿时间呈现二项式分布，当色谱柱的塔板数很高的时候，二项式分布趋于正态分布。
则流出曲线上组分浓度与时间的关系可以表示为：C_t=\frac{\sigma\sqrt{2\pi}} e^{-\frac{(t-t_R)^2}{2\sigma^2}} 这一方程称作流出曲线方程，式中Ct为t时刻的组分浓度；C0为组分总浓度，即峰面积；σ为半峰宽，即正态分布的标准差；tR为组分的保留时间。
层析法 色谱法
层析法色谱法层析法和色谱法都是现代化学分离技术的代表，它们广泛应用于生命科学、制药、化工等领域。
层析法是通过将混合物分离成不同的化合物分馏，分别被吸附在固体材料的不同区域，最终通过逐一反向洗脱的方法分离成单一组分。
层析法有多种类型，例如纸层析、薄层层析、气相层析、离子层析和凝胶层析等。
纸层析是一种简单的动态层析技术，特别适用于生物材料的色素和其它天然产物的分离。
薄层层析是一种静态层析方法，采用由超薄硅基板制成的薄（0.1-0.5mm）多孔度的二氧化硅层面。
离子层析和凝胶层析则是两种常见的固相高效液相色谱。
层析法具有处理任务多样、样品迅速处理和分离效率高等优点。
它可以将大量样品快速地分离，并且不需要高温和高压。
同时，它还可以根据需要选择不同类型的层析方式，以得到更好的结果。
例如，凝胶层析可以分离具有不同形状、大小和电荷特性的发酵液蛋白质样品。
色谱法的分离原理是根据组分在固定相和流动相中的分配系数不同，使流动相中的混合物分离成单一组分。
色谱法的主要类型有气相色谱、液相色谱和离子色谱等。
气相色谱是目前应用最广的色谱方法之一，主要用于气态分子分离和分析。
它的分离依据是各种气体和固体、液体之间的化学亲和力、大小排列不同等作用。
液相色谱是利用需要分离的混合物在液相和固定相中存在不同亲和性来实现分离。
液相色谱广泛应用于生物化学、制药、地质、环境保护、食品工业等领域，能够分离各种化合物，包括有机化合物、天然产物，以及大分子类的物质，例如蛋白质和核酸。
离子色谱则是一种能够分离大量离子化合物的稳定色谱，它可以自动地定量分析各种离子化合物，例如常见的硫酸盐和硝酸盐等。
总的来说，层析法和色谱法是现代化学分离技术中最常见且重要的方法之一。
它们在各个领域中发挥着不可替代的作用，我们相信随着科技的发展，这两种方法将更加成熟和广泛应用。
第一节层析技术
应用：平板色谱法在染料、农药、医药、 有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸 、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析 中经常被使用。也可以用于无机离子的分
离。还经常作为高效液相色谱的一种预试
方法。
4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下
用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显
色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。
特点及应用
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低，
•
•
可以在一块层析板上同时展开多个试样及
采用方形薄层板还可以方便的进行二维展
将多条滤纸同时展开。
开，即按一般方法展开后，改变方向和展开
• 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小
• 洗脱体积 • 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，
为洗脱体积
Ve Vm K dVs
• 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗
脱体积也有所差异
• 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 • 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 •
最大限度地满足疏水的要求
• 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）
来增大蛋白质和多肽的疏水性
• 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ）
• •
Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和 四氢呋喃
薄层色谱法
• 将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离
的方法 • 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 • 优点：
《液相层析色谱技术》课件
05
液相层析色谱技术 的挑战与展望
技术挑战与解决方案
分离效果不佳
当样品组分复杂时，液相层析色谱技术的分离效果可 能会受到影响。
分离速度慢
液相层析色谱技术的分离速度相对较慢，需要优化以 提高分离效率。
样品处理难度大
对于某些特殊样品，如生物大分子、蛋白质等，液相 层析色谱技术的样品处理难度较大。
技术挑战与解决方案
原理
通过流动相携带待分离物质通过 固定相，利用不同物质在固定相 上的吸附、溶解等性质差异实现 分离。
发展历程与现状
发展历程
液相层析色谱技术自20世纪初诞生以 来，经历了不断改进和发展，技术不 断完善和提高。
现状
目前液相层析色谱技术已经成为生物 医药、食品、环保等领域中重要的分 离分析工具，应用广泛。
多维分离技术
为了更好地分离复杂样品，液相层析色谱技术将与多种分 离技术结合，形成多维分离技术，进一步提高分离效果。
智能化与自动化
随着人工智能和自动化技术的发展，液相层析色谱技术将 实现智能化和自动化操作，提高分析效率和准确性。
应用领域拓展
随着技术的不断进步和应用需求的增加，液相层析色谱技 术的应用领域将进一步拓展，包括生物医药、环境监测、 食品安全等领域。
技术成本高
液相层析色谱技术需要高昂的设备和试剂成本，限制了其在 某些领域的应用。
解决方案
通过改进分离介质、优化流动相组成、提高检测灵敏度等手 段，提高分离效果和分离速度；同时，开发新型的样品处理 方法和技术，降低处理难度；此外，降低技术成本也是重要 的解决方向。
未来发展方向与趋势
提高分离效率
未来液相层析色谱技术将更加注重提高分离效率，通过改 进分离介质和优化分离条件，实现更快速、高效的分离。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作(3)
层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作(3)柱层析的基本装置及基本操作目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。
(1)柱层析的基本装置柱层析的基本装置，如图2－21 。
(2)柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤：①装柱柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。
一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。
否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。
一般柱子的直径与长度比为1:10~50，凝胶柱可以选1:100～200。
然后将柱子洗涤干净。
将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸(0.5～1mol/L)、碱(0.5 ~1mol/L)、盐(0.5~ 1mol/L)溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。
然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起)，以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm 高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液，吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。
注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。
②平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液 (有一定的pH 和离子强度)平衡柱子。
用恒流泵在恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同。
平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。
如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。
有时柱子平衡好后，还要进行转型处理，这方面的内容将会在离子交换层析中加以介绍。
③加样加样量的多少直接影响分离的效果。
薄层色谱和柱层析
薄层色谱和柱层析一、薄层色谱（TLC）1.原理：薄层色谱是一种基于分子在固体表面和流动相之间相互作用的分离技术。
它使用薄层固定在玻璃或铝板上的吸附剂（例如硅胶或氧化铝）来分离混合物中的化合物。
在色谱板上涂覆样品后，通过液态或气态的流动相让混合物成分在吸附剂上移动，不同化合物的移动速度不同，从而实现分离。
2.应用：薄层色谱被广泛应用于药物化学、食品科学、环境科学和生命科学等领域。
它通常用于混合物的分析，确定混合物中是否存在特定化合物。
此外，它也可用于纯化样品中的化合物，通过可视化或其他检测方法来定位目标化合物位置。
3.操作步骤：薄层色谱的操作步骤主要包括：（1）准备色谱板：将吸附剂均匀涂覆在固定的玻璃或铝板上，使其成为薄层。
（2）样品的涂覆：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，并用微量移液管将样品均匀地涂覆在色谱板上。
（3）开展分离：将涂覆了样品的色谱板悬挂在色谱槽中，加入合适的溶剂溶液，使之满足色谱板的一端。
（4）显色：在色谱板完全干燥后，通过目视或化学法将化合物可视化。
常用的显色剂包括碘、紫外线灯或化学染色剂。
二、柱层析（CC）1.原理：柱层析是一种基于分子在固定填料（固相）和流动相之间相互作用的分离技术。
根据样品的特性选择不同的固相材料，并将其装填在柱中。
当样品通过柱时，不同化合物与固相发生不同程度的相互作用，从而分离。
2.应用：柱层析广泛应用于化学和生物化学领域，用于分离和纯化化合物。
它可用于药物合成中的纯度检查、食品中毒素的分离、蛋白质的纯化等。
柱层析的分离效果通常较好，纯度高。
3.操作步骤：柱层析的操作步骤主要包括：（1）准备填料和柱子：根据需要选择适当的固相材料，并将其装填在柱子中。
（2）样品的预处理：将待分离的样品预处理，如溶解在适当的溶剂中，并清除杂质。
（3）样品注入：将样品注入柱中，注意控制样品体积和注入速度。
（4）洗脱：通过加入不同组成的洗脱液（流动相），使样品中不同化合物以不同速率从柱中洗脱。
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的分子与同一单位时间内的该介质的同一表面上解吸附的分
子达到了动态平衡，处于该环境中吸附介质的吸附作用达到 饱和。
吸附剂的选择
性能：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定
性强、成本低廉
极性：羟基磷灰石，硅胶，氧化铝，人造沸石 非极性：活性炭
吸附剂
活性炭 硅胶 氧化铝 聚酰胺 羟基磷灰石
2、等电点沉淀
在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋 白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成 沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分 子散开，溶入水中。
3、有机溶剂沉淀
降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电 荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚 度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增 强，从而产生沉淀。
四、层析基本操作过程
装置选择上样和洗脱结果 Nhomakorabea测基质均匀性 柱层析的L/d比值
上样均一性 洗脱装臵
目的不同 检测方法不同 活性检测
1、柱层析的L/d比值
2、洗脱装置
不改变溶剂体系
依靠液面的水位差产 生的静压力致使洗脱液不 断流经层析柱 缺点：随着溶液的流去， 水位差也逐渐减小，流速 也在变小。
薄层层析法
纸层析法
薄膜层析法
纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
气体
气-液层析法
超临界分析：利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点 的条件下进行分离，更具专一性。
按操作形式不同分类
名称 操作形式
层析分类法
柱层析法
固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
将适当粘度的固定相均匀涂铺 在薄板上，点样后用流动相展 开，使各组份分离 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离 将适当的高分子有机吸附剂制 成薄膜，以类似纸层析方法进 行物质的分离
4、层析装置的仪器化
HPLC
与电脑、质谱等连用
伯乐公司duoflow中高压层析仪
安马西亚公司akta高效快速层析仪
液相层析技术
概况
分离范围： 无机化合物 有机化合物 生物大分子 活体生物
应用范围： 大规模生产 小型制备、微量分离 定性定量分析
液相层析仪
伯乐公司duoflow中高压层析仪
三、层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉 淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的 蛋白与其它较大量的杂蛋白分开， 这些方法的特点是简便、处理量大、 既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白 质，但分辨率低。
1、盐析法
盐离子与水分子作用，原来溶液中大 部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而 降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用， 破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的 蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。
层析技术的原理
层析系统都由两个相组成：一是固定相 (不动的一相)， 它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是 流动相 ( 携带样品流过固定相的流动体 ) ，即可以流动的物质， 当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存 在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能 力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互 作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向 前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向 前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各 单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
层析技术
第一节 层析概述
一、概况
层析法也称色谱法 (chromatography)，是1906年俄 国植物学家Michael Tswett发现 并命名的。他将植物叶子的色素通 过装填有吸附剂的柱子，各种色素 以不同的速率流动后形成不同的色 带而被分开，由此得名为“色谱 法”。 后来无色物质也可利用吸附柱层析 分离。
吸附介质的分类及其性质（一）
改变溶剂系统
♦ 梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处 于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中， 经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为 洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶 液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。 注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存 在两个性质接近的蛋白质。
线性梯度洗脱装臵
♦性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱→若为单峰：分级洗脱
3、结果检测
活性检测
比活没有提高
目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋 白的生物活性
结果保存
薄层层析&纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分 仪变成数据
柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理
将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，对其中 的组分用合适的分析方法分别进行测定。
现代色谱（online)
当一个二组分（A和B）的混合样品在t1时间从柱头加入; 随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组 分先后流出柱子而进入检测器; 从而使各组分浓度转变成电信号后记录在记录纸上，或 显示在荧光屏上，或由电脑贮存后打印出来。
性、溶解度、稳定性等）选择缓冲溶液及其浓度、 pH值、离子强度、缓冲容量等。
保护剂：抗氧化剂、稳定剂、蛋白酶抑制剂等
有机溶剂：根据待检测物质的极性及溶解度来选
择不同极性的溶剂。
第一节 吸附层析
吸附层析
定义：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物 中的各组分分离的方法。
原理：层析介质表面的吸附基团对溶质发生吸附作用， 该基团对不同溶质的吸附能力的强弱有较大的差异，可 根据这种差异性，将不同溶质进行分离。
凝胶层析法/排阻层析
亲和层析法
按层析原理分类（二）
名称 分配层析 分离原因 被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的 作用，在移动的过程汇总物质在两相之间进行分配。 利用固定相载体表面偶联的疏水性配基与流动相中的一些 疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。 利用固定相载体表面偶联的疏水性较强的配基，在一定非 极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极 性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物 质。 利用固定相载体表面偶联的载体两性电解质分子，在层析 过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子 发生等点聚焦反应进行分离的方法。 利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与 流动相中溶质分子相对分子量的差异进行分离的方法。
二、层析法的特点
分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异 构体。
灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级
的物质量。
分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试 样的分析。
应用范围广
不足之处：被分离组分的定性较为困难。
层析应用范围
凡是溶于水和有机溶剂的分子和离子，在性质上有 一定差异均可通过层析方法进行分离。 分离的范围包括：
HPLC以分析为主。
通过层析方法可以对物质进行一定程度的定量、 定性和纯度鉴定。
按层析原理分类（一）
名称 吸附层析法 金属螯和层析法 离子交换层析法 分离原理
组份在吸附剂表面吸附固定相的能力不同
利用二价金属离子与流动相中的含有半胱氨 酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯和 作用而进行分离的方法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂 亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同， 因而在凝胶上受阻滞的程度不同 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以 此和无亲和力的其它组份分离
疏水层析
反向层析
聚焦层析
灌注层析
按层析过程的机理分类 离子交换层析：利用不同组 分对离子交换剂亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同 分子大小的组分阻滞作用的不同。
吸附层析：利用吸附剂表面对 不同组分吸附性能的差异，达 到分离鉴定的目的。
按两相所处状态分类
流动相 液体
液体 固定相 固体 液-固层析法 气-固层析法 液-液层析法
原理
根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不 同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异 来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的 过程，达到分离目的。 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华 力和偶极力相互作用。
吸附力的产生
吸 附
吸附：任何两相都可以形成界面，其中一相的 物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发生 密集行为。
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢
均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
流动相
流动相
缓冲溶液：根据待分离物质的性质（等电点、极
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过； 在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺