引物设计保护碱基列表
引物保护碱基列表格
11月13日引物合成的详解需要什么级其余引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
依据实验需要，确立订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<45base OPC一般PCR扩增>45base PAGE诊疗PCR扩增<40base OPC,PAGE DNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等依据实验要求定OPC,PAGE，HPLC基因建立（全基因合成）依据实验要求定PAGE反义核酸依据实验要求定PAGE修饰引物依据实验要求定PAGE,HPLC怎样计算引物的浓度？答：引物保留在高浓度的状况下比较稳固。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
一般状况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按以下方式计算：V(微升)=OD数*（乘）33*（乘）（乘）20000/(除)引物的分子量。
引物的分子量能够从合成报告单上获取。
假如需要配制成其余浓度，按上述公式换算。
注意：1OD260=33ug/ml.怎样计算引物的Tm值？答：引物设计软件都能够给出Tm，与引物长度、碱基构成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)关于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=+xLog10[Na+]+(%GC)–600/size公式中，Size=引物长度。
怎样溶解引物？答：干燥后的引物质地特别松散，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末采集到管底。
依据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTris缓冲液，室温搁置几分钟，振荡助溶，离心将溶液采集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这类条件下不稳固。
怎样保留引物？答：引物合成后，经过一系列办理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下能够长久保留。
引物设计保护碱基列表
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)To test the varying requirements restriction endonucleases have for the number of bases flanking their recognition sequences, a series of short, double-stranded oligonucleotides that contain the restriction endonuclease recognition sites (shown in red) were digested. This information may be helpful when choosing the order of addition of two restriction endonucleases for a double digest (a particular concern when cleaving sites close together in a polylinker), or when selecting enzymes most likely to cleave at the end of a DNA fragment.The experiment was performed as follows: 0.1 A260 unit of oligonucleotide was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase and γ-[32P] ATP. 1 µg of 5´ [32P]-labeled oligonucleotide was incubated at 20°C with 20 units of restriction endonuclease in a buffer containing 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT and NaCl or KCl depending on the salt requirement of each particular restriction endonuclease. Aliquots were taken at 2 hours and 20 hours and analyzed by 20% PAGE (7 M urea). Percent cleavage was determined by visual estimate of autoradiographs.As a control, self-ligated oligonucleotides were cleaved efficiently. Decreased cleavage efficiency for some of the longer palindromic oligonucleotides may be caused by the formation of hairpin loops.| A | B | C | E | H | K | M | N | P | S | X |。
引物设计保护碱基列表上课讲义
引物设计保护碱基列
表
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
保护碱基列表。
保护碱基列表
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Hind III
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
切割率%
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CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
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XhoI
CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG
保护碱基列表
010>90>900
Pvu I
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10
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Sal I
GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGGTCGACGCGTCGGCCATAGCGGCCGCGACGCGTCGACGAA
.
PCR设计引物时酶切位点的保护
酶
寡核苷酸序列
%切割率
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20 hr
Acc I
CGGTCGACCGCGGTCGACCGGCCGGTCGAC
000
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7510CTCGAGCGGCCG
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注释：'端加55‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的1．如果要加在序列的‘端加保护碱基，就在酶切位点识上相应的碱基（黑色），相同如果要在3 '端加上相应的碱基（黑色）。别碱基序列（红色）的3 2．切割率：正确识别并酶切的效率3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。4 / 4
保护碱基列表(基础教育)
PCR设计引物时酶切位点的保护酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc I G GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG 0Afl III C ACATGT GCC ACATGT GGCCC ACATGT GGG>90>90>90>90Asc I GGCGCGCCA GGCGCGCC TTT GGCGCGCC AA >90>90>90>90>90>90Ava I C CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA50>90>90>90>90>90BamH I C GGATCC GCG GGATCC CGCGC GGATCC GCG10>90>9025>90>90Bgl II C AGATCT GGA AGATCT TCGGA AGATCT TCC7525>90>90BssH II G GCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAA50>90BstE II G GGT(A/T)ACC C010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATGCATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT252550>90Cla I C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG>9050>9050EcoR I G GAATTC CCG GAATTC CGCCG GAATTC CGG >90>90>90>90>90>90Hae III GG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAA >90>90>90>90>90>90Hind III C AAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1075Kpn I G GGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCG>90>90>90>90Mlu I G ACGCGT CCG ACGCGT CG2550Nco I C CCATGG GCATG CCATGG CATG5075Nde I C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC7575>90>90Nhe I G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG10102550Not I TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA10102525101090>90Nsi I TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT10>90>90>90Pac I TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG 025>90Pme I GTTTAAACG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CCAGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG752550>90Pst I G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT10>90>9010>90>90Pvu I C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA102510Sac I C GAGCTC G1010Sac II G CCGCGG CTCC CCGCGG GGA50>90Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA10105075Sca I G AGTACT CAAA AGTACT TTT 10752575Sma I CCCGGGC CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA10>90101050>90Spe I G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG 1010>90>905050Sph I G GCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC ATGT102550Stu I A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT >90>90>90>90>90>90Xba I C TCTAGA GGC TCTAGA GCTGC TCTAGA GCACTAG TCTAGA CTAG>907575>90>90>90Xho I C CTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGG10102575Xma I C CCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA2550>9075>90>90注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
引物设计保护碱基列表
在分子克隆试验中，有时我们会在待扩增目标基因片段两端加上特定酶切位点，用于后续酶切和连接反应。
因为直接暴露在末端酶切位点不轻易直接被限制性核酸内切酶切开，所以在设计PCR引物时，人为在酶切位点序列5‘端外侧添加额外碱基序列，即保护碱基，用来提升未来酶切时活性。
添加保护碱基，需要考虑两个原因：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心应该是保护碱基数目，而不是种类。
什么样酶切位点，添加多个保护碱基，是有数据能够参考，见附表。
添加什么保护碱基，假如严格点，是依据两条引物Tm值和各引物碱基分布及GC含量。
假如某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
保护碱基列表。
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在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC 含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
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