羊口疮病毒云南流行毒株的分子鉴定
山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析
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１ ・ 上 ０ ７年 第 ６期
山羊痘 云 南 流行毒株 及疫 苗株 Ｐ ２基 因序列 分析 ３
姚 俊 李华春 高华峰 单于乃 纯 高 林 张念祖 （云南省 热带亚热 带动物 病毒病 重点 实验室 国家外来 动物疫 病诊 断实验室 昆明 金殿 ６０２ ５ ２ ４）
本 文对 我 省 山羊 痘 流行 毒 株 及 疫 苗 株 进 行 Ｐ ２基 因序 ３
hinfi酶切位点有成功用于鉴别羊痘病毒属成员的报道5本研究中也成功应用于对gtpv和sppv的鉴别即对待检毒株病毒p32基因pcr产物做hinfi酶切分析即可将gtpvlsdv病毒与sppv病毒鉴别开再结合流行病学及临床症状可以非常容易地把gtpv与sldv相区别开来因疙瘩皮肤病lsd主要是牛的一种病毒性传染病绵羊和山羊很少感染在人工接种后大多只在皮肤局部形成轻度的暂时性肿胀所以在流行病学及临床症状上很容易与山羊痘鉴别开来这在诊断上具有重要意义
【 要 】将 本 实验 室 分 离到 的 山羊 痘 病 毒 云 南 流行 毒 株 ＭＹ 、 Ｗ 、 Ｄ 及 疫 苗株 ＶＦ 摘 ＳＸ Ｘ ４主 要 结构 蛋 白基 因 Ｐ ２基 ３ 因克 隆 到 Ｐ １ Ｔ载 体 后 进 行 双 向 测 序 ， 得序 列 与 Ｇ ｎ ａｋ中羊痘 病 毒 属 成 员 ： ＭＤ ８ 所 ｅｂｎ 山羊 痘 病 毒 （ Ｔ Ｖ） 绵羊 瘟 病毒 Ｇ Ｐ 、 （Ｐ Ｖ）疙 瘩 皮 肤 病 病 毒 （Ｌ Ｖ） 考毒 株 相 应 序 列 作 对 比 分析 （ ｙ ｌ ｔｗ ｔｏ ）结 果 显 示 ：１ ＭＹ 、 Ｄ 毒株 ＳＰ 、 ＳＤ 参 Ｂ ｃｕ ａ Ｍｅｈｄ ， ｓｌ （） ＳＸ Ｐ ２基 因全 长 ９ ９ｂ ， 苗株 Ｖ ４为 ９ ４ｂ ， Ｗ 毒 株 为 ９ ５ｂ 。（ ） Ｗ 、 苗 株 ＶＦ ３ ６ ｐ 疫 Ｆ ７ ｐ Ｘ ７ ｐ ２ Ｘ 疫 ４在 １０ ０ ｐ 置 处 均 插入 ０ ～１５ｂ 位 ６个 Ａ， ９ ７ｂ 位 置缺 失一 个 Ｔ；Ｐ Ｖ 参 考 毒 株 在 １９ ７ ｐ 置插 入 ＧＡ 在 ４ ｐ ＳＰ ６ ～１ １ｂ 位 Ｔ。 （ ） ３ 由于 疫 苗 株 Ｖ ４Ｐ ２基 因核 Ｆ ３ 苷 酸 序 列 第 ４ ４位 置 处 发 生 了 Ｔ Ａ 突 变 ， 该 处 形 成 一 个新 的终 止 密 码 予 Ｔ Ａ， 致 完整 的 开放 读 码 框 架 （ Ｒ ） １ ／ 在 Ａ 导 Ｏ Ｆ 被 打 断 ， 表 达 第 １ ｌ ｐ １ ７个 Ａ ） 基 因 片段 ， 只 ～４ １ｂ （３ ａ的 而不 能 表 迭 出完 整的 Ｐ ２蛋 白 。其 余 ６株 毒 株 的 开放 读 码 框 架 均 ３ 很相似 。（ ） ４ 在所构建的系统发 生树 中，Ｓ Ｖ与 Ｓ Ｐ ＬＤ Ｐ Ｖ参考毒株 、 Ｓ和 Ｘ ＭＹ Ｄ株 、 Ｆ Ｖ ４和 Ｘ 株、 Ｔ Ｖ参考毒株各 Ｗ Ｇ Ｐ 被 划 分 为一 组 。 所有 ７个毒 株 Ｐ ２基 因核 苷 酸 序 列 的 同 源性 都很 高 ， 在 ９ ％ 以上 。 其 中疫 苗 株 ＶＦ ３ 均 ７ ４与 Ｓ Ｐ 参 ＰＶ 考毒 株 的 同源 性 最 低 ， ９ ． ％。 Ｘ 与 Ｘ 毒 株 的 同 源 性 最 高 ， ９ ． ％。 （ ） 切 位 点 分 析 结 果 显 示 ， Ｓ 为 ７６ Ｄ Ｗ 为 ９８ ５酶 ＭＹ 、 Ｘ 、 Ｄ、 ４及 Ｇ Ｐ Ｗ Ｘ ＶＦ Ｔ Ｖ和 Ｓ Ｄ Ｌ Ｖ参考毒株具有唯一 的 Ｈ ｎ Ｉ ｉｆ 酶切位点， 大约在第 ６ ４ｂ 位置 。Ｓ Ｐ ９ ｐ Ｐ Ｖ参考毒株具有 ２个 Ｈ 酶切 位 点 ， 别 在 第 ３ １ｂ ｍｆ Ｉ 分 ９ ｐ和 ６ １ｂ 位 置 处 ， 酶 切 位 点 较 适 合 用 来 鉴 别 山 羊 痘 和 绵 羊 疽 病 毒 ， ９ ｐ 该 而疙 瘩 皮肤 病 在 临 床 上 就很 容 易与 山羊 痘 和 绵 羊 痘鉴 别 开来 。 关 键 词 ：山羊 痘病 毒 ； ３ Ｐ ２基 因 ； 隆 ； 克 测序 ； 列 分析 序 山羊 痘 是 由 山 羊痘 病 毒 引 起 的 一 种 严 重 的 、 度 接 触 传 高 染 的动 物 疾病 ， 仅 给 养 羊 业 造 成 重 大 经 济 损 失 ， 限 制 了 不 还 国际 贸 易 及 外 来 优 良 品 种 的 引 进 【 ， 国 际 兽 疫 局 １ 被 ］ ０Ｉ （ ｆｃ ｎｅ ａｉ ａ ｄｓＥ ｉ ｏｉ ） 为 Ａ 类 动 物 传 染 Ｅ Ｏｆ ｅＩｔ ｎｔ ｎｌ ｅ ｐ ｏｔ ｓ 列 ｉ ｒ ｏ ｚ ｅ 病 。临 床 上 以体 温 升 高 、 身 性 或 局 部 性 皮 肤痘 疹 及 内脏 病 全 变 （ 别 是肺 ） 至死 亡 为 特 征 【 。 山羊 痘 病 毒 （ Ｔ Ｖ） 痘 特 乃 １ Ｇ Ｐ 属 病 毒科 （ｏ ｖ ｉａ） 索 动 物 亚 科 （ｈｒｏ ｏ ｒ ａ ） 痘 病 毒 ｐｘ ｉｄｅ 脊 ｒ ｃｏｄ ｐｘｉ ｅ 羊 ｎ 属 （ａｒ ｏｖ ｕ ） 成 员 ， 属 其 它 成 员 还 有 绵 羊 痘 病 毒 ｃｐｉ ｘｉ ｓ 的 ｐ ｒ 该 （ Ｐ ｖ）疙 瘩 皮肤 病 病 毒 （ Ｓ Ｖ）１ ， 种 病 毒 之 间 有 着 密 ｓＰ 、 Ｌ Ｄ ’ 三 切 的遗 传 学关 系 ， 清学 上 不 易 区别 开 Ｈ 。 血 Ｊ ２０ ０ ２年 ８月 中 旬 ， 云南 省 富源 县 从 四川 省 引进 黑 山羊 种 羊后 ， 当地 黑 山 羊群 暴 发 了 山 羊痘 ， 继 在 昆 明官 渡 、 山 、 相 西 嵩明、 石林 、 曲靖 、 宣威 、 江 、 蒗 、 河 等 地 州 县 引 起 流 行 。 丽 宁 红 此次 山羊 痘 的流 行 给 我 省 养 羊业 造 成 了 重 大 经 济 损 失 ， 严 也 重阻 碍 了优 良 品种 的改 良推 广 。部 分 疫 区 报 道 称 ， 苗 接 种 疫 后引 起 孕 羊流 产 、 发病 及 流 行 。 国 外 也 有 报 道 称 因 接种 山 羊 痘疫 苗 引 起发 病 及 流 行 。因 此 有 必 要 对 当 前 流行 毒 株 及 疫 苗株 的主要 抗 原 基 因 进行 核 苷酸 序 列 测 定 及 分 析 ， 确 定 此 以 次流 行 是 否 由疫 苗 毒 株 引起 。
羊口疮病毒B2L和VIR基因原核表达及抗原性鉴定
均 能与兔抗羊 口疮病毒 抗血清结合 ， 证明 Ｂ ２ Ｌ 、 ＶＩ Ｒ蛋 白具有 与羊 口疮病毒共 同的 Ｂ细胞表位 。 关键 词 ： 羊 口疮 病毒 ； Ｂ ２ Ｌ基 因； ＶＩ Ｒ基 因 ； 原核 表 达 ； 抗 原性
（ 西 北 农 林 科 技 大 学 动 物 医学 院 ， 陕西 杨 凌 ７ １ ２ １ ０ ０ ）
摘 要 ： 为检 测羊 口疮病毒 （ Ｏｒ ｆ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） Ｂ ２ Ｌ和 Ｖ Ｉ Ｒ蛋 白的抗原性 ， 通过 Ｐ Ｃ Ｒ方法扩增 出羊 口疮病毒 Ｂ ２ Ｌ和 ＶＩ Ｒ基 因， 与原核表 达载体 ｐ Ｅ Ｔ － ３ ２ ａ连接 ， 将重组质粒 转化 到 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 感 受 态中， 对其进 行 Ｂ ａ ｍＨ Ｉ 和 Ｈｉ ｄ Ⅲ双酶切鉴 定和测序验证 。对 鉴定为 阳性 的茵液进行 诱 导表 达 ， 并进行 Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ Ａ Ｇ Ｅ分析 。用 灭活 的羊 口疮病
似性 为 ９ ２ ～９ ４ ［ １ ， Ｂ ２ Ｌ基 因编 码 氨基 酸序 列 的 相似 性为 ９ ７ ． １ ～９ ８ ． ７ 口 ， 这两 种 蛋 白都 可刺 激
１ ． １ ． １ 病毒 、 载 体 和 宿 主 细 胞 原 核 克 隆 载 体
ｐ ＧＥ Ｍ－ Ｔｅ ａ ｓ ｙ购 自Ｐ ｒ ｏ ｍｅ ｇ ａ公 司 ； 羊 口疮细 胞毒 、 表
宝生 物 工 程 （ 大连） 有 限公 司； Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ５ ｋ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 、 Ｂ ｌ ｕ ｅ
Ｐ ｌ ｕ ｓ Ｉ Ｉ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ ， 购 自北京全式金 生物技 术有限 公司； Ｓ ａ ｎ Ｐ ｒ ｅ ｐ柱 式 Ｄ ＮＡ 胶 回收 试 剂 盒 、 Ｓ ａ ｎ Ｐ ｒ ｅ ｐ柱 式质 粒 Ｄ ＮＡ小量 抽提试 剂 盒 ， 购 自上海 生工 生 物工
羊口疮病毒的分离与鉴定
护 效 果 。 毒 后 各 组 鸡 死 亡 率 及 保 护 率 显 示 ，Ｆ Ｖ 组 、 攻 ｒＰ ＨＶＴ 组 和 ｒＰ Ｆ Ｖ＋ ＨｖＴ 组 鸡 群 的 死 亡 率 分 别 为 ３ 、 ３ 和 １ ； ３ ３ ７ 相
对 应 各 组 鸡 群 的 保 护 率 分 别 为 ６ 、 ７ 和 ８ 。 显 示 ｒ Ｐ ７ ６ ３ Ｆ Ｖ 组 和 ＨＶＴ组 的 免 疫 保 护 效 果 一 致 ， 低 于 ｒ Ｐ － 但 Ｆ Ｖ４ ＨＶＴ 二 联 疫 苗 的 免 疫 保 护 效 果 ， 明 ｒ Ｐ 和 ＨＶＴ 冻 干 疫 苗 具 有 免 疫 说 Ｆ Ｖ 协 同作 用 。 ３ ３ 试 验还 测 定 了疫 苗 免 疫 后 对 各 组 鸡 群 体 重 的 影 响 情 况 。 ．
被 广 泛 用 于 ＭＤ 的 预 防 。 但 由 于 Ｍ Ｄ 倾 向 于 向 更 高 的 毒 力 Ｖ
结果 显示 ， 毒 后各 免疫 组鸡 群 的体 重基 本 一致 ． 明 显高 于单 攻 但
纯攻 毒组 ， 于正常 对 照组 。 低 ３ ４ 随 着 对 ＭＤＶ 基 因 组 结 构 与 功 能 的 深 入 研 究 以 及 对 ＭＤＶ ．
维普资讯
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Ｃｈ ｎ ｓ ｏ ｒ ａ ｆＶｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｓ ｉ ｎ ｅ ａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏ ｏ ｙ Ｖｏ ． ２ Ｎｏ ９ ２ ０ ｉ ｅ ｅ Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｔ ｒｎ ｒ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌ ｇ １３ ． ０ ２
［ ］ 殷 震 ， 景 华 ．动 物 病 毒 学 ［ ］ １ 刘 Ｍ ．第 ２版 ．北 京 ： 学 出 版 科
社 。 ９ ７ １９ ．
［ ］ Ｗ ｉ ｅ ．Ｃ ｎｒｌ ｔａｅ ｉ ｏ ａｅ ’Ｓｄｓａｅ：Ａ ２ ｔｒ Ｌ ｔ Ｒ ｏ ｔ ｒｔｇｅ ｆｒＭ ｒｋ ｉ ｓ ｏｓ ｓ ｅ ｐ ｒｐｃｉｅｆｒｔｅｆｔｒ Ｊ ．Ｐ ｕｔｙＳ ｉ ｃ 。 ９ ８ ． ７ ｅｓ ｅ ｔ ｈ ｕｕ ｅＦ ］ ｏ ｌ ｃｅ ｅ １９ ７ ： ｖ ｏ ｒ ｎ
羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用
羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用向智龙;刘芳;冉光鑫;鲜思美;程振涛;卓建华;欧德渊;文明;周碧君;尹传宝;吴飞;冯会利【摘要】根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2010(038)007【总页数】3页(P145-147)【关键词】羊口疮病毒;PCR;特异性;敏感性【作者】向智龙;刘芳;冉光鑫;鲜思美;程振涛;卓建华;欧德渊;文明;周碧君;尹传宝;吴飞;冯会利【作者单位】贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;湖北省京山县畜牧兽医局,湖北,京山,431800;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,动物科学学院,贵州,贵阳,550025【正文语种】中文【中图分类】S858.26羊口疮是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的山羊、绵羊接触性、嗜上皮性传染病[1]。
本病为一种人兽共患病，通过直接接触或间接接触传染，发病动物以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤与粘膜形成水疱、丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂为特征，敏感羊群发病率高达90%，病死率1%～25%[2]，给养羊业带来了巨大的经济损失。
山羊痘云南流行毒株的分离鉴定及P32基因PCR—RFLP分析
经本 动 物 回归 试 验 、 Ｃ 鉴 定 为 山羊 痘 病 毒。 另 Ｐ Ｒ
外 ， 对 这 ３株 野 毒 株 的 Ｐ ２基 因 进 行 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ 还 ３ Ｃ —Ｆ Ｐ 分 析 （ Ｃ ｅｔ ｃｉｎ ｆ ｇ ｎ ｅ ｇｈ ｐ ｌｍｏ Ｐ Ｒ ｒｓｒ ｔ ｒ ｍｅ ｔ ｌｎ ｔ ｏｙ ｒ ｉ ｏ ａ
ＹＡＯ ｕ ，Ｌ ｕ — ｈ ｎ，ＧＡＯ ａ ｆｎ Ｊｎ ＩＨ ａｃ ｕ Ｈｕ —ｅ ｇ，Ｓ ＡＮＹＵ ｉ ｈ ｎ，ＧＡＯ ｉ ，Ｚ ＡＮＧ ａ － ｕ Ｈ Ｎａ－ ｕ ｃ Ｌｎ Ｈ Ｎｉｎ ｚ
（ ｅ Ｋｅ ｂ ｒ ｔ ｒ ｆＴｒ ｐ ｃ ｌａ ｄ Ｓ ｂ ｒ ｐ ｃ ｌＡｎｍ ａ Ｖｉ ｌ ｇ Ｔｈ ｙ Ｌａ ｏ ａ ｏ ｙ ｏ ｏ ｉａ ｎ ｕ ｔｏ ｉａ ｉ ｌ ｒ ｏ ｙ， ｏ
Ｎ ａ ｉｎａ ｉｇ ｓｓ Ｌａ ｏｒ ｔ ｙ ｏｆＥｘ ｉ ｎｍ ａ ｓ ａ ｅ ｔｏ ｌＤ ａ ｎｏ ｉ ｂ ａ ｏｒ ｏｔｃ Ａ ｉ ｌＤｉｅ ｓ ｓ，Ｋ ｕｎ ｉ ｇ ６ ２ ４，Ｃｈｉ ） ｍ ｎ ５０ ２ ｎａ
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔｈｒ ｅｓ ｒ ｉ ｆＧ ＴＰＶ ｅ ｅｉ ｏ ａ ｅ ｒ ｍ ｌ ｓｒ ｃ ： ｅ ｔａ ｎｓｏ ｗ ｒ ｓ ｌ ｔ ｄ ｆ ｏ １ ｕｎｇ ｓ ｍ ｐｌ ｓｃ ｌｃ ｅ ｒ ｍ ｏ ｔａ ｆｌａ ｅ ｉｈ ２ ａ ｅ ｏｌｅ ｔ ｄ ｆ ｏ ｇ ａ ｆｉｉ ｔ ｄ ｗ ｔ ｐｏ ｎ Ｙ ｕ ａ ｉ ｇ ＢＴ ｅ ｌ． Ｔｈｅ ｅ ｅｉ ｅ ｉｉ ｄ ｂｙ ａ ｍ ａ ｅ ｔ ｘ ｉ ｎｎ ｎ ｕｓｎ ｃ ｌｓ ｙ ｗ ｒ ｄ ｎｔｆｅ ｎｉ ｌｔ ｓ ，ＰＣＲ ｎｄ ＰＣＲ～ ＦＬＰ ｎｄ ｗ ｅ ｅ ｎ ｍ ｅ ａ Ｒ ａ ｒ ａ ｄ ａ Ｙ Ｓ。Ｘ Ｗ ｎｄ ＸＤ ｔ ａｎｓ ａ ｃ ｄ ｎｇ ｔ ｈ ｍ ｅ ｏ ａ ｅ ｈｅ ｅ ｔ ｅ ｅ ｅ ｉ ｏ ａ ｅ ． ｓＭ ａ ｓ ｒ ｉ ｃ ｏｒ ｉ ｏ ｔ ｅ ｎａ ｆｐｌ ｃ ｓｗ ｒ ｈ ｙ ｗ ｒ ｓ ｌ ｔ ｄ Ｋｅ ｒ ｓ：ｇ ａ ｐ ｉｕｓ ｉｏ ａ ｉ ｙ ｗｏ ｄ ｏ ｔ ｏｘ ｖ ｒ ； ｓ ｌ ｔｏｎ； ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｄ ｎ ｉｉ ａ ｉ ｎ；ＰＣＲ— ＦＬＰ Ｒ
羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能分析
羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能分析随着基因组测序技术的发展，多株羊口掩病毒的全基因组序列已被测定。
尽管病毒全基因组功能预测分析能为羊口痛致病的分子机制研宄提供参考，但是基因组学技术研究只能针对病原体自身，而不能反映病原体与宿主间的相互作用，仅靠基因组学技术揭示病毒致病机制具有一定的局限性。
本文主要就是针对羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能来进行分析。
标签：羊口疮病毒;蛋白质组变化;功能1、羊传染性脓痕研究进展羊传染性脓疽俗称羊口疮，是由羊口疮病毒（Orfvirus，ORFV）所致的一种人兽共患传染病，主要影响小反自动物，有时也会感染骆驼、牛、鹿、犬等其他物种。
临床上患病动物以嘴唇周围开始出现丘疹和脓疤，继而溃烂形成厚状结痴为特征。
该病发病率高，病死率低。
但若继发细菌和真菌感染以及寄生虫的入侵等将会导致死亡率上升。
羔羊也常因口腔病变引发进食困难，使其死亡率高达93%。
该病暴发严重影响农民的收入。
同其他痘病毒一样，ORFV能够逃避宿主免疫系统的监视，形成持续性感染，从而加大了临床防控该病的难度。
（1）病原学与基因组羊口疮病毒属于痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，副痘病毒属，是一双链DNA病毒。
电镜下可见病毒粒子大小为200～350nm×125～75nm，外层类囊膜包裹内部双股DNA核心。
ORFV作为副痘病毒属中的典型代表物种，主要影响小反当动物，也可感染其他宿主包括骆驼、牛、鹿、廖牛、幼犬、和人等。
最近有报道称。
RFV能感染猫和驯鹿，意味着病毒宿主范围在扩大。
ORFV的基因组为一条长约135kb的双链DNA分子，具有封闭的末端发结构。
GC含量高达63%}-64%。
基因组中央区域为中心编码区且高度保守，为病毒复制和形态形成所必需，而基因组两头末端区域与病毒毒力和致病性有关。
基因图谱研究显示ORFV横跨88kbp的中央编码区与正痘病毒属的典型代表物种牛痘病毒（vacciniavirus，V ACV）相似，但是基因组末端处出现的插入、缺失和易位等突变显示了两者高度的差异，导致同一属中各物种间以及不同属之间进一步的变异。
羊口疮病毒的分离与鉴定
羊口疮病毒的分离与鉴定庞方圆;高日明;李旭东;闫聪;李浩;王艳杰;张七斤【摘要】本试验利用犊牛睾丸细胞、羔羊睾丸细胞、MDBK、BHK-21细胞对采自内蒙古赤峰的疑似羊口疮发病羊群的唇部痂皮组织进行接种传代,分离出1株病毒,通过透射电镜负染观察和PCR检测对该分离株进行鉴定.参照GenBank中羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059 (F1L)基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的F1L基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行了同源性比对分析,结果显示经透射电镜负染观察到典型的副痘病毒粒子,与参考毒株序列相比均具有较高的同源性,均为96％以上,结果表明该分离株为ORFV,命名为OV/nm-hd.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)002【总页数】5页(P467-471)【关键词】羊口疮病毒;分离鉴定;F1L基因;序列分析【作者】庞方圆;高日明;李旭东;闫聪;李浩;王艳杰;张七斤【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;金宇保灵生物药品有限公司,呼和浩特010030;兽用疫苗国家工程实验室,呼和浩特010010;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;金宇保灵生物药品有限公司,呼和浩特010030;兽用疫苗国家工程实验室,呼和浩特010010;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;金宇保灵生物药品有限公司,呼和浩特010030;兽用疫苗国家工程实验室,呼和浩特010010;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;兽用疫苗国家工程实验室,呼和浩特010010【正文语种】中文【中图分类】S852.65羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)引起的一种急性、高度接触性的人兽共患传染病，其在临床上以在动物口、唇、鼻、乳房等部位皮肤出现水疱、脓疱为主要特征[1]。
该病于1787年首次在英国发生，世界各养羊地区羊群中不断有该病暴发和流行[2]。
云南流行山羊痘病毒的PCR鉴定及基因序列分析
１ １ 材料 所采 病 料 大部 分 为 出现 山羊 痘 典 型症 ． 状的濒 死 山 羊 的 心、 、 、 、 等 实 质 器 官 。 肝 脾 肺 肾
ＧＰ１ ＧＰ２ ＧＰ３ ＧＰ 、 、 、 ４为 采 自 云 南 省 发 病 黑 山 羊 流
行毒株 的 组织 毒 ； Ｐ Ｇ ５为 疫 苗 毒 株 （ 胞 毒 ） 测 序 细 ； 参考 毒株 ｐ ｌ ｒ Ｐ 为 山羊 痘 野 毒 Ｇｅ Ｂ ｎ ｅｌ （ Ｌ） ｏ ｎ ａ ｋ登 录 号 为 ＡＹ０ ７ ３ ； ２ － ＫＶ（ ７ ８ ５ Ｇ ０Ｌ ＧＶ）为 山 羊 痘 疫 苗 毒 ＡＹ ７ ８ ６ Ａ（ Ａ）为 绵 羊 痘 野 毒 ＡＹ０ ７ ３ ； ０ ７３ ； Ｓ ７ ８ ３ ＴＵ （ Ｕ） Ｔ 为绵 羊 痘 野毒 ＡＹ０ ７ ３ ； ｓ ｈ（ ７ ８ ２ Ｎｉ ｉＮＫ）为 绵 ｋ 羊痘疫 苗毒 ＡＹ０ ７ ３ ； ｅｈｉｇ ４ ０ Ｉ Ｄ）为 疙 ７ ８ ４ Ｎｅｔ １ ２ ９ （ ｎ Ｓ 瘩 皮 肤 病 野 毒 ＡＦ ２ ５ ８ ３５２ 。 １ ２ 试 剂 Ｐ Ｒ Ｋｉ 及 Ｐ ｅ ｘＴ ｑ酶 均 购 自宝 生 ． Ｃ ｔ ｒｍｉ ａ 物 工 程 （ 连 ） 限 公 司 ； 回 收 试 剂 盒 及 小 量 柱 式 大 有 胶 质粒 纯 化 试 剂 盒 ， 量 病 毒／ 体 样 品 总 Ｒ 小 液 ＮＡ ＤＮＡ 快 速 抽 提 纯 化 试 剂 盒 ， 购 自上 海 华 舜 公 司 。 均 Ｔｈ ｒ ｅ ｕ ｎ ｓ ５Ｄｙ ｒ ｎ ｔ ｒｋ ｔ 序 试 ｅｍｏＳ ｑ ｅ ａ ｅＣｙ ｅＴｅ ｍｉａｏ ｉ 测 剂 盒 及 Ｒｅ ｒ Ｇｅ ｎ ａ 胶 购 自 Ａｍｅ ｓ ａ ｐ ｏ ｌＬｏ ｇ Ｒｅ ｄ ｒ ｈ ｍ Ｐ ａｍａ ｉ 司 ； 仿 、 丙 醇 等 其 他 试 剂 均 为 国 产 ｈｒ ｃ ａ公 氯 异 的分 析 纯 试 剂 。 克 隆 测 序 质 粒 ｐ Ｄ ８Ｔ ｖ ｃｏ 购 Ｍ １ 一 ｅｔ ｒ 自宝 生 物 工 程 （ 连 ） 限 公 司 ； 大 有 ＤＨ５ ａ菌 株 由 ＹＴ — Ｓ ＡＶＤ 提 供 。 Ｌ １３ 引 物 设 计 设 计 如 下 １对 引 物 ， 于 扩 增 ． 用 Ｓ ＶＦ基 因 片 段 ： ＶＦＦ ５ Ｓ ＣＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＴＴＣ 一
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Ｆ ＯＲ ０ ０基 因 的 Ｄ Ｖｇ Ｆ １ ＮＡ 序 列 符 合 率 达 ９ （６ ／ ８ ｂ ） ９ ９７９１ｐ ，
仅有 １ ４个 ｂ ｐ发 生 变 异 。 所 测 出 的 ９ １ｂ Ｆ Ｏ Ｆ １ ８ ｐＯＲ Ｖｇ Ｒ ０ ０基 因序 列 为 ：
பைடு நூலகம்
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图 ５ 阳 性对 照 和 送 检 样 品 均 扩 增 出 １２ ５ｂ ２ ｐ大 小 的 目的 片 断 。 健 康 山羊 皮 肤 组 织样 品未 扩 增 出 目的 片 断
Ｍ ： ＮＡ Ｍａｋ ｒ Ｄ ２ ０ ） ＋ ： Ｄ ｒ ｅ（ Ｌ ０ ０ ； 阳性 对 照 ； ： 检样 品 ； ： Ｓ送 一 阴性 对照 。
ｌ ０ ｐ — ０ｂ ０ —
２ ０ ｐ ．．－ ０ ｂ ． — —— ０ ．－ ．－
ｇｎ 纯 化 后 ， １ １ 泳 检 测 ， 然 可 见 明 亮 的 目 的 条 带 ， ｅ） 取 Ｏ“ 电 仍
即 将 纯 化 的 Ｐ Ｒ产 物 送 Ｉ ｖｔ ｇ ｎ公 司 测 序 。测 出 的 Ｏ Ｃ ｎｉ ｏ ｅ ｒ Ｒ—
ＣＣＣＣＡ ＧＣＡＣＣＴ ＡＣＴＣＧＣＧ ＣＣＣＣＧＡ ＣＡＣＣＧ ＡＧ ＧＴＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＧＡ ＣＧ ＴＧＣＡＣＡ ＣＣＧＣＣＧ ＣＴ ＡＧ ＣＧＣＴＧ Ａ ＣＴＣＣＴＧＧＧ ＣＧＣＡ ＧＣＣＡ ＣＡ ＣＧＴＴＣＡ ＣＧＣＧＣＣＣＴＣＴＧＧ ＣＡ Ａ ＣＡ ＧＣＧＴＧＧ ＣＣＧＣＣＴＧＧＴ ＴＣＧ ＴＧＴ ＡＣＣＧＣＴ Ｔ ＣＧＧ ＣＡ ＧＣＡ ＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＣＴＧＡ ＡＣＴＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧ ＡＣＧＡ ＡＣＧＣＣＧ ＧＣＣＣＣＧ ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＣＧＧＣＧ ＡＣＴＧ ＣＧＣＧＡ Ａ ＧＣＴ ＧＧＴＧＧ ＴＧＣＧＣＧＡ ＣＴ ＴＣＣＴＣＡ ＴＧＴＧ ＧＣＴＧＡ ＣＧ ＡＣＧＴＧ ＣＡ Ａ ＧＧＡ ＡＡ Ａ ＣＡ ＴＣＡ ＣＣＧＴＧ ＴＡ ＣＧ ＧＣＴＴＣＴＡ ＣＡ ＧＣＴＣＣＴＴ ＣＴ ＴＣＧ ＡＣＡＣＧＣＧＧＣＡＧ ＧＴＣＡ ＴＧＧＡ ＧＣＴＣＧＣＣＧ ＧＣＡ Ａ ＧＧＧ ＣＴ ＧＧＡ ＣＧ ＣＧ ＣＡ ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＧ ＡＡ ＣＡ ＣＧ ＣＴ ＧＣＴＣＴ ＣＣＡＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＡＡ ＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＴ ＴＣＧＴＧＧ ＡＣＣＴＣＧ ＣＧ ＣＡ ＣＴＴＣＧＣＧＣＣＣＧＣ ＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧ ＡＧ ＴＡＣＴＧＣＧＡ ＧＴ ＴＣＴ ＧＧＧＧ ＣＧ ＧＣＧ ＴＣＴＧＴＧ ＴＧＧ ＡＣＧＴＧ ＣＣＣＧ Ａ ＡＧＡ ＣＧＴＧ ＧＴＣＴＣ ＣＧＣＧＧ ＡＣＧＡ ＧＡＧ Ｃ Ａ ＧＧＡ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧ ＣＧＣＴＣＴＣＧＧ ＡＣＧＣＧＧＣＧ
Ｄ ＮＡ 中 所 含 的 病 毒 拷 贝 数 。
２ 结 果
２ １ 电 泳 检 测 结 果 ．
电 泳 检 测 结 果 显 示 扩 增 出 明 亮 的 １ ２ ５ｂ ２ ｐ大 小 的 目的 片 断 （ 图 ５ 。该 Ｐ Ｒ 产 物 经 Ｄ 见 ） Ｃ ＮＡ 片 断 纯 化 试 剂 盒 （ ａ — Ｔｉ ｎ
阳性 对 照 及 检 测 样 品 的 融 解 曲 线 均 为 单 一 峰 ， 示 无 非 提
特 异 性 反 应 （ 图 ７ 。Ｔｍ值 为 ７ ． ４℃ 。 见 ） ４２
＾ ｃ ｍ口 蜘 Ｐ０ ｌ ｔ
一
２
重ａ ，
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Ｆ ＯＲＦ １ Ｖｇ ０ ０基 因 序 列 经 ｃ ｎｉｇｘ ｒ ｓ ｏｔ ｇ ｐ ｅｓ软 件 校 正 后 ， 得 获
９ １ｈ ８ ｐ序列 。所 获 序 列 在 ＮＣ Ｉ ｅ Ｂ ｎ Ｂ ｎ ａ ｋ中进 行 Ｄ Ｇ ＮＡ序 列 同 源 性 Ｂ ＡＳ 后 ， 羊 口 疮 病 毒 基 因 组 （ Ｌ Ｔ 与 ＡＹ３ ６ ６ ） Ｒ～ ８２４ Ｏ
ＴＣＧ ＧＡ ＣＧ ＴＡＧＧ ＣＣＴＣＴＡ ＣＧ ＡＣＣＴ ＧＣＧ ＣＡ ＴＧ ＧＴＣＴＣＧ ＣＡ ＣＧＡＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＣＧ ＧＣＴＣＧＧＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧ
ＣＧＣＣＧ ＧＣＡＧ ＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧ ＡＡ ＣＧ ＴＧＴＧ ＣＴ ＧＣＧ ＴＧＧ ＧＣＡＧＣＴＡ ＣＧＣＣＡ ＴＣＴＧＧ ＡＴＣＡ ＡＡ Ｇ Ａ
２ ２ Ｓ Ｒ ｅ ｎ Ｉ法 实 时 荧 光 定 量 Ｐ ． ＹＢ Ｇｒ ｅ ＣＲ 检 测
结 果
Ｍｌ ｕ ｅ ｅ Ｃｒ ｔ ｖ
阳 性 对 照 及 检 测 样 品 均 扩 增 出 ｓ形 标 准 曲线 ， 阴性 对 照
未 出现 任 何 峰 。当 域 值 （ ｈ ｅｈ ｌ ） ０ １时 ， 性 对 照 及检 Ｔ ｒｓ ｏｄ 为 ． 阳 测 样 品 ｃ 值 分 别 为 ２ ． １ ２ ． ４见 图 ６ 。 ｔ ４ ９ 、２ ６ （ ）
ｌ
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４・
《 海 畜牧 兽 医通 讯 》 ２ １ 上 ０ ２年 第 ３期
１ Ｏ倍 系 列 稀 释 ， 取 １ １ ｃ ｐｅ／／ 至 １ ０ ｃ ｐｅ／ｕ 选 × ０ ｏｉ ｓ ， １ ｘ１ 。 ｏ ｉｓ １
共 ５个 稀 释 度 作 标 准 曲 线 ， 定 量 检 测 组 织 样 品 所 抽 提 以