羊口疮病毒B2L基因密码子优化及截短表达

２０１８年第３５卷第１０期羊口疮病毒B2L基因密码子优化及截短表达张　静，范峻豪，刘春羽，赵　一，温永俊，张七斤（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特　010018）摘　要：B2L蛋白是羊口疮病毒（ORFV）的结构蛋白，也是病毒的保护性抗原，可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。

为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性，将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计，并截取抗原性高、疏水性好的区域，构建了His-tag融合可溶性标签的表达重组载体，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，经IPTG诱导，利用SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测，筛选出高可溶性表达的His 融合蛋白。

重组蛋白通过Ni-NTA agarose亲和纯化后，进行Western-blot验证。

结果显示，经过SDS-PAGE和Western- blot鉴定的目的条带分子质量与预期大小相符。

本试验成功在上清中表达和纯化出B2L基因编码蛋白。

关键词：羊口疮病毒；B2L基因；截短表达；密码子优化中图分类号：S852.43 文献标识码：A 文章编号：1005-944X（2018）10-0095-04DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2018.10.025Codon Optimization and Truncated Expression of the B2L Gene of ORFVZhang Jing，Fan Junhao，Liu Chunyu，Zhao Yi，Wen Yongjun，Zhang Qijin （College of Veterinary，Inner Mongolia Agriculutural University，Huhhot，Inner Mongolia　010018，China）Abstract：The B2L protein is a structural protein of the sheep's aphthous virus（ORFV）and is also the protective antigen，which can stimulate the body to produce strong antiviral reaction. In order to express highly soluble B2L protein and to detect the immunogenicity，the codon bias of B2L gene was optimized，then the region with high antigenicity and good hydrophobicity was intercepted，and the His-tag recombinant vector was constructed，the recombinant plasmids were transformed into E. coli BL21（DE3）. After induced by IPTG，the solubility of expressed recombinant protein was tested by SDS-PAGE electrophoresis，and the highly soluble His-tag protein was screened. At last，the recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose affinity and verified by Western-blot. The results showed the molecular weight of the band determined by SDS-PAGE and Western-blot was consistent with the expected size，hence B2L protein was successfully expressed and purified in the supernatant.Key words：ORFV；B2L gene；truncated expression；codon optimization羊口疮（ORF）是由羊口疮病毒（ORFV）感染山羊和绵羊引起的一种急性、接触性传染病，人偶有感染。

本病以羊口唇、乳房等处的皮肤和粘膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结痂等为主要特征[1-2]。

ORFV全基因组大小为135~139 kb，为双链线性DNA病毒，基因组包含131个基因，其中B2L基因位于基因组的左末端。

病毒在宿主细胞内增值时，B2L基因在病毒DNA尚未开始复制时便大量转录翻译42 ku大小的蛋白。

该蛋白是ORFV 外囊膜的主要成分，可强烈刺激宿主免疫系统产生免疫应答[3-4]。

本研究截短表达了ORFV B2L基因，并依照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化，使其在原核表达系统中进行融合表达，纯化出高浓度重组蛋白，为后续建立ORFV血清学检测方法提供了重要的抗原物质，尤其是为建立ORFV间接ELISA方法奠定了物质基础。

1　材料与方法1.1　主要试剂Ni-NTA Agarose亲和纯化柱、Binding Buffer基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0500903）通信作者：张七斤和Elution Buffer：购自生工生物工程（上海）有限公司；180 ku蛋白预染 Marker：购自Thermo 公司；Anti-His Mouse mAb、100 ku蛋白预染Marker：购自全式金生物技术有限公司；Anti-Mouse IgG：购自SIGMA；PVDF膜：购自Bio-Rad；蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus：购自上海碧云天生物技术有限公司；BL21（DE3）感受态细胞：购自天根生化科技（北京）有限公司。

其他试剂均为标准化学分析纯试剂。

1.2　主要仪器Trans-Blot SD半干转印槽：美国Bio-Rad公司；Alph Imager HPr凝胶成像系统：美国Protein Simple公司；双垂直蛋白电泳仪：中国百晶生物公司；脱色摇床：中国五相仪器仪表公司。

1.3　B2L蛋白截短及密码子优化运用DNA Star中的Protean软件，分析B2L 蛋白的亲水性、可塑性、蛋白表面可及性、抗原指数；根据分析结果截取抗原指数高、亲水性好、可塑性好的片段进行截短表达和密码子优化；将优化好的片段送吉林库美生物有限公司进行合成，然后连接到pET32a（+）表达载体上，再转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。

1.4　重组蛋白表达将重组菌划线接种于含Amp+的LB固体培养基37℃过夜培养，将过夜菌挑单菌落接种于3 mL 含氨苄抗性的新鲜 LB液体培养基，摇菌培养12 h；按1%的比例将纯化培养的菌液接种于200 mL含Amp+的新鲜LB液体培养基，37℃200 r/min震荡培养；用分光光度计测A到0.6时，加入IPTG诱导；将菌液12000 r/min离心10 min，弃上清，用Binding buffer洗涤2次，然后重悬，于冰浴中进行超声破碎（具体以超声菌液清亮为止）；将超声裂解菌液4℃12000 r/min离心10 min，分离上清和沉淀；将沉淀用尿素溶解，经过SDS-PAGE电泳测定，并且以未诱导菌为阴性对照。

1.5　重组蛋白纯化将Ni-NTA Agarose亲和纯化柱加入5 mL Binding Buffer平衡10次，将蛋白加入平衡好的Ni-NTA镍柱填料中，在冰上结合30 min；收集流穿液，加5 mL Binding Buffer洗涤1次，收集洗涤液，加Elution Buffer 5 mL洗1次，收集洗脱液。

1.6　重组蛋白Western-blot鉴定将经SDS-PAGE电泳的蛋白条带转印到PVDF膜上，电压14 V 1 h；用5%脱脂乳室温封闭2 h，然后用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；在膜上加入Anti-His Mouse mAb为一抗（1:4000稀释），4℃过夜孵育，第2天用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；再将膜放入1:5000稀释的Anti-Mouse IgG中孵育1 h，取出膜后用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；在PVDF膜上加ECL显影液，放于荧光显色仪中显色。

2　结果与分析2.1　B2L蛋白截短及密码子优化2.1.1　B2L蛋白截短　利用DNA Star中的Protean 软件，分析B2L蛋白的亲水性、可塑性、蛋白表面可及性、抗原指数等，选取抗原指数高、亲水性好、可塑性好的片段进行截短表达。

分析结果见图1-A，截取的目的蛋白氨基酸序列见图1-B。

A. Protean软件对B2L蛋白的分析，红框标出的为截短的蛋白部分；B. B2L蛋白截短后氨基酸序列图1　B2L蛋白的生物信息学分析２０１８年第３５卷第１０期2.1.2　B 2L 蛋白截短基因的密码子优化　根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，用E. coli Codon Usage Analyzer 2.1在线软件分析优化结果。

结果显示（图2），优化后的密码子适应指数（CAI ）为1，且无稀有密码子。

CAI 是反映编码区同义密码子与密码子最佳使用相符合的程度，取值范围在0~1之间，越高表明该基因的密码子使用偏好性越强[7-8]。

2.3　重组蛋白SDS-PAGE 分析将重组表达载体转入大肠杆菌BL 21（DE 3）感受态中，经条件优化，最终确定37 ℃ IPTG 终浓度为1 mmol/L 诱导培养3 h 后表达的效果最佳。

SDS-PAGE 检测结果见图3。

从结果中可以看出，诱导的pET 32a （+）-B 2L 重组菌超声后上清及沉淀中的30 ku 附近出现清晰条带，而未诱导的PET-32a-B 2L 重组菌在这一位置没有这一条带，因此认为B 2L 重组蛋白得到了成功表达。

2.4　重组蛋白纯化将诱导表达得到的B 2L 蛋白经镍柱亲和层析后收集到的流穿液、洗涤液和洗脱液，分别取20 µL 进行SDS-PAGE 电泳，可以看出流穿液和洗涤液中也有　重组蛋白存在，但洗脱液中的重组蛋白单一，因而认为重组蛋白得到较好的纯化（图4）。

图2　密码子优化分析结果（CAI 为1）M. 180 ku 预染Maker ；1. 未诱导的PET-32a-B2L 重组菌；2. 诱导的PET-32a-B2L 重组菌超声后上清；3. 诱导的PET-32a-B2L 重组菌超声后沉淀图3　SDS-PAGE检测结果M. 100 ku Marker ；1. 纯化后收集的流穿液；2. 纯化后收集的洗涤液；3. 纯化后收集的洗脱液图4　SDS-PAGE 电泳结果2.5　重组蛋白Western-blot 检测Western blot 结果见图5。