羊口疮病毒贵州株B2L基因的克隆及其分子特征分析

羊口疮病毒贵州株B2L基因的克隆及其分子特征分析摘要:根据已发表的ORFV B2L基因序列设计引物,进行B2L基因的特异性扩增,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序｡结果表明,贵州株的B2L基因长为1 137 bp｡核苷酸序列比较､分析,结果表明,贵州株与湖北株(GU320351)同源性最高,达99.1%,与2003年北美分离株(AY278208)和2003年美国动物园分离株(AY424971)同源性最低,为97.1%,所推导氨基酸的同源性为96.3%~99.5%｡说明贵州株B2L基因与参考毒株之间差异不大｡该研究为贵州省羊口疮病毒疫苗选择提供理论基础｡关键词:ORFV;克隆;序列分析Cloning and Its Molecular Characteristics Analysis of the B2L Gene of Orf Virus Isolated in GuizhouAbstract: According to the published B2L gene sequence of ORFV strain in Genbank,one pair of primer was designed.The B2L gene of orf virus was amplified with the primer by PCR and then cloned into pMD18-T plasmids and sequenced. The acquired sequences contained 1 137 bp. The homology analysis revealed that the homology of the strain Guizhou strain and the Hubei strain(GU320351)was 99.1%, homology of the Guizhou strain and the North American orf virus isolated(AY278208)in 2003, and isolated strain from various ruminant species of a zoo(AY424971) in 2003 was 97.1%. The homology of deduced amino acid sequence shared 96.3% to 99.5%. There were a little variation between Guizhou strain and the reference virus strains. The test provided a theoretical basis of selection the Orf virus vaccine for Guizhou province.Key words: ORFV; clone; sequence analysis羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的绵羊､山羊的一种接触传染性､嗜上皮性､人兽共患的传染病[1]｡ORFV在养羊的国家和地区普遍发生,常呈群发性流行[2],是严重威胁养羊业,具有重要经济意义的病毒病之一[3]｡我国甘肃､宁夏､四川､江苏､云南､青海､陕西､山东､内蒙､新疆､贵州､黑龙江等省区均有此病的流行与报道[4-9]｡ORFV为痘病毒科(Poxviridae)､副痘病毒属(Parapoxvirus)成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,基因组大小约135.0~148.1kb[10], G+C含量约64%[11];目前公认含16个开放阅读框(ORF),由130个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成｡在ORFV基因组中,BamHⅠ酶切片段的B2L基因(靠近G和E片段,距基因末端约10 kb处,长约1 137 bp)是一个完整的阅读框,B2L基因编码42 kDa 蛋白质｡该蛋白是病毒囊膜的成分之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应,并刺激淋巴细胞释放[12],是ORFV的保护性抗原之一[13],42 kDa蛋白诱导的免疫反应足以抵抗强毒的攻击｡本试验针对羊口疮病毒的B2L基因设计特异性的引物,对贵州株进行PCR扩增,并进行分子特征分析,旨在了解羊口疮贵州株与国内毒株及国际毒株间的差异,以便深入了解羊口疮贵州株的分子特性,为羊口疮的诊断及防治奠定基础｡1材料与方法1.1材料ORFV贵州分离株采自于镇远某发病羊场,由贵州省动物疫病研究室实验室保存｡1.2引物本试验参考GenBank中的ORFV的B2L基因的全基因序列,设计了1对特异性引物为:ORFV(F):5′-ATGTGGCCGTTCTCCTCCATC-3′;ORFV(R):5′-TTAATTTATTGGCTTGCAGAACT-3′｡预期目的片段为1 137 bp｡以上由宝生物工程(大连)有限公司合成｡1.3病毒DNA的抽提将病料痂皮研磨,按1∶10的体积比加入含双抗(青霉素､链霉素各2 000 IU/mL)的0.01 mol/L pH值7.2 PBS缓冲液中,置4℃冰箱浸渍12~16 h,12 000 r/min离心10 min,取上清,采用SDS-蛋白酶K法提取DNA｡1.4PCR扩增PCR反应体系如下:ddH2O 33 μL,10 × buffer 5 μL,dNTPs(各10 mmol/L)1 μL,MgCl2(25 mmol/L)3 μL,上､下游引物各2.5 μL(10 pmol/μL),模板2 μL,Taq DNA 聚合酶1 μL(2.5 U/μL),总体积为50 μL｡PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环后,72℃延伸10 min｡取扩增产物8 μL,于含有0.5 mg/L溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳检测｡1.5PCR产物回收､连接转化参照宝生物胶回收试剂盒说明书进行｡1.6扩增产物的克隆取适量目的片段,加入pMD18-T载体及高效连接液(ligation solutionⅠ),于16℃连接过夜,取10 μL连接产物转化感受态DH5α菌,涂布于含X-gal､IPTG和Amp 的LB固体平板上,37℃培养12~16 h｡经蓝白斑筛选转化菌,SDS碱裂解法小剂量制备质粒DNA｡1.7重组质粒的PCR鉴定以质粒DNA为模板,对重组质粒进行PCR扩增｡1.8重组质粒的酶切鉴定用BamHⅠ和HindⅢ酶切重组质粒(37℃酶切3 h),1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果｡1.9核酸序列测定采用Sanger’s双脱氧链终止法测序,将2个反应所测序列用DNAStar软件包中的Seqman软件对比矫正,并用DNAStar的MegAlign软件对所测核酸序列进行比较和分析｡2试验结果2.1PCR扩增结果用设计的特异性引物扩增本实验室保存的羊口疮病毒,将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析,得到与预期相符的1 137 bp片段(图1)｡2.2重组质粒PCR鉴定结果用设计的特异引物对重组质粒进行PCR扩增,得到与预期相符的1 137 bp片段,结果见图2｡2.3重组质粒酶切鉴定结果用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ对重组质粒进行鉴定,37℃3 h后,用琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果,结果显示切出pMD18-T载体的2 700 bp和B2L基因的1 200 bp两条带,与预期结果相符(图3)｡2.4序列测定结果将经PCR鉴定为阳性重组质粒的克隆菌送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定,并应用计算机软件对测得的序列进行拼接,获得ORFV贵州株B2L基因核苷酸序列,B2L基因的长度为1 137 bp,其核苷酸序列见图4｡2.4.1贵州分离株与其他分离株核苷酸同源性将本试验克隆测序的1株贵州分离株与17株Genbank中已发表的羊口疮B2L基因进行比较分析,与Genbank中已发表羊口疮序列间的核苷酸同源性为97.1%~99.1%(图5)｡2.4.2贵州分离株与其他分离株氨基酸同源性本试验克隆测序的羊口疮贵州株B2L基因与GenBank中已发表的羊口疮B2L基因进行比较分析,与GenBank中已发表的羊口疮序列间的氨基酸同源性为96.3%~99.5%(图6)｡2.4.3遗传进化树分析用Oligo软件绘制羊口疮病毒B2L基因的遗传进化树,经分析,贵州株与GenBank中已发表的中国台湾2007年分离株(登录号:DQ904351)和中国湖北2009年分离株(登录号:GU320351)的序列为同一病毒株,与2005年分离于印度山羊的口疮病毒同属于一个进化分支(登录号:DQ263303和DQ263304)(图7)｡3分析1)羊口疮病毒基因组全长约135.0~148.1 kb,不同种､不同毒株略有差异[3]｡B2L 基因编码约42 kDa的蛋白,此蛋白是ORFV的囊膜成分,为主要保护性抗原之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应｡本研究对贵州分离株ORFV B2L 基因的测序及分子特征分析,为贵州省的疫苗选择提供理论依据｡2)本研究通过提取羊口疮病毒DNA进行PCR扩增､克隆､分子特征分析,成功地获得了B2L基因编码序列,共1 137 bp,编码379个氨基酸,与国内外已发表的羊口疮病毒B2L基因核苷酸序列同源性高达99.1%;推导的氨基酸序列与羊口疮病毒B2L基因编码的氨基酸同源性高达99.5%｡从同源性的分析结果来看,本试验所研究的1株羊口疮病毒贵州分离株与GenBank收录的17株羊口疮毒株该片段的同源性非常高,这说明B2L基因具有高度的保守性｡3)在本试验中,以所提取的DNA为模板,ORFV1､ORFV2为引物,PCR扩增得到了一条约1 137 bp的特异条带,与试验设计的预期结果一致｡用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ对PCR产物进行的双酶切鉴定结果表明,酶切产物中出现2条带,大小分别为2 700 bp的pMD18-T的线性片段和约1 200 bp的插入片段,这与测序结果相符合,表明在本试验中已获得了羊口疮病毒的B2L基因｡本研究不仅为病毒分子生物学特性的研究提供了参考依据,还为原核表达载体的构建及其表达产物的免疫生化特性的研究､真核表达载体的构建并作为核酸疫苗防治羊口疮病毒奠定了坚实的基础｡参考文献:[1] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997.977-980.[2] 左玉婷,靳诚,王锡贞.羊传染性脓疱皮炎[J].中国兽医科技,1987(3):56-58.[3] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.动物传染病学[M].北京:中国农业出版社,1998.363-365.[4] 丁久耐,于瑞顺.青龙县羊传染性脓疱病调查报告[J].河北畜牧兽医,1986(1):5-17.[5] 丁再隶,何家惠, 刘立仁. 羊传染性脓疱皮炎在江苏的首次确诊[J].畜牧与兽医,1992(2):76.[6] 改树清,刘慧纯,王志明.羊传染性脓疱口炎的调查报告[J].黑龙江畜牧兽医,1983(4):4-8.[7] 何水林,陈杰,蔡玉书.羊口疮病毒的分离鉴定[J].中国兽医科技,2002(9):22-23.[8] 王明珠,于春林,白斯琴,等.羊传染性脓疱的流行与防治[J].中国兽医杂志,2002(10):49-50.[9] 徐毅,陈无暇,王光伟.山羊爆发传染性脓疱皮炎[J].中国兽医杂志,2002(3):47-48.[10] GASSMANN U,WYLER R,WITTEK R. Analysis of parapoxvious genomes[J].Arch Virol,1985,83(1-2):17-31.[11] ROBINSON A J,BARNS G,FRASER K,et al.Conservation and variation in orf virus genomes[J]. Virology,1987,157(1):13-23.[12] 黄引贤,李乃津.羊传染性脓疱病毒的某些特性的初步研究[J].中国兽医杂志,1986,12(4):2-5.[13] SULLIV AN J T,MERCER A A,FLEMING S B,et al. Identification and characterization of an orf virus homologue of the vaccinia virus gene encoding the major envelope antigen p37K[J].Virology,1994,202(2):968-973.。