分枝杆菌 微生物学检验
结核分枝杆菌、厌氧菌及其它微生物的检测
最终鉴定需要进行生化反应及终末代谢产物等检 查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验 硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂 酶试验、明胶液化试验、硫化氢试验等——厌氧 API条。
目前用于厌氧菌快速鉴定还有自动微生物鉴定系 统等。
实验内容
1、记录抗酸染色步骤。 2、油镜下观察抗酸杆菌涂片，并记
厌氧菌的分离与鉴定
（三）标本接种
标本接种3个血琼脂平板，分别置于有氧、 无氧和含5-10%CO2的环境中培养。若只 要求检测厌氧菌，只需接种1个厌氧血琼 脂平板。
厌氧菌的分离与鉴定
（四）耐氧试验
当厌氧血平板上有细菌生长时，为了确 定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。挑 取菌落分别转种2块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板，然后将平板分别放 置在需氧、厌氧和CO2环境中培养。
荧光染色结果报告
—：观察70个视野未发现抗酸杆菌； ±：70个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：50个视野内发现2-18条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现36条以上抗酸杆菌。
厌氧菌的分离与鉴定
厌氧菌标本的采集 涂片与染色 标本接种 耐氧试验 鉴定试验
干后油镜下观察结果。
抗酸染色结果观察
油镜下观察涂片，在淡蓝色背景下可见染成红 色细长或分枝状杆菌，此为抗酸染色阳性细菌 。
抗酸染色结果报告
—：观察300个视野未发现抗酸杆菌； ±：300个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：100个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现9条以上抗酸杆菌。
实验室检验项目的分类
实验室检验项目的分类
实验室检验是临床诊断过程中必不可少的一部分。
实验室检验的项目
很多，按照其检验内容和目的，可分为以下几类：
1. 临床生化检验：主要检测患者的生理、代谢功能和营养状态等方面
的指标，如血浆蛋白、血压、血糖、脂肪酸等。
2. 体液检验：主要检测人体各种体液的化学、生理、免疫学等方面的
指标，如脑脊液、胸腔积液、尿液等。
3. 免疫学检验：主要检测患者的免疫状态和免疫功能，如人类免疫缺
陷病毒(HIV)检测、肝炎病毒检测等。
4. 微生物学检验：主要用于细菌、真菌、病毒等病原体的检测和鉴定，包括细菌药敏试验、肺结核分枝杆菌检测等。
5. 分子生物学检验：主要检测人体基因、DNA、RNA等分子水平上的信息，如PCR检测、基因突变检测等。
以上五类实验室检验项目是临床医学中常用的检测分类。
在医生选择
检测项目时，应根据不同患者和不同疾病发展的特点和需要，选择相
应的检测项目，以便更快、更准确地进行病情诊断和治疗。
此外，在进行实验室检验时，应确保检验方法、设备和材料的质量和安全性，并保护患者的隐私和个人信息，提高医学检验的可靠性和准确性。
微生物学--细菌检验基本技术
• 常用的指示剂：酚红、中性红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、 甲基红等
一、培养基
（二）培养基分类
1．按成分分类
• 合成培养基：是人工合成，组分明确，都是无机盐和化学 纯物质组成的培养基 • 天然培养基：也称复合培养基。是指含有化学成分不完全 明了或各批物质的成分很难一致的天然物质所组成的培养基， 如蛋白胨、牛肉膏、肉浸液、鸡蛋、马铃薯等。细菌检验常 用
一、培养基
6．灭菌 • 高压蒸汽灭菌
• 无糖：103．4kPa
121．3℃维持
15~20min
• 有糖： 68．95kPa 115℃ 维持
15min
• 间歇蒸汽灭菌法：血清、牛乳、鸡蛋 • 血清凝固器灭菌
一、培养基
7．质量检验 • 无菌试验：将制好的培养基在35℃温箱培养过夜，判定是否 灭菌合格 • 效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的 生长、菌落形态、色素、溶血及生化反应等特征，判断培养基 是否符合要求
（2）结果 抗酸性细菌和非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
三、细菌染色标本的检查
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查
3．其他染色方法
（1）鞭毛染色 （2）荚膜染色
第二节 细菌的培养与分离技术
重点提示
• 培养基的主要成分及作用 • 培养基的种类 • 培养基制备的基本程序 • 细菌接种与培养方法 • 细菌在培养基中的生长现象
2020/2/28
7
常用诊断流程
• 表解法 区别比较复杂细菌，将各种细菌及其多 种
特性列成矩阵表格，使相互区别点十分明显，便于分析 比较
•
肠杆菌科初步分属
微生物第章 分枝杆菌属
微生物第章：分枝杆菌属一、概述分枝杆菌属（Bacillus）是革兰氏阳性的芽孢杆菌科中最常见的属之一。
其名称来源于其在培养基上形成的分枝的菌体形态。
该属菌体大小相对较大，形态多样，包括直形、杆形、梭形或球形等不同类型。
分枝杆菌属包括很多种类的细菌，一些种类在自然环境中很常见，有着重要的生态、工业和医学应用价值。
二、生态学和鉴定分枝杆菌属中的细菌生活在许多不同的环境中，包括土壤、水、植物、食品和动物的肠道中。
细菌在自然环境中存在着极为广泛的分布，在枯萎的植物、渣滓、泥炭、海水和河流等地方都可以发现其存在。
在实验室条件下，分枝杆菌属可以通过形态特征、代谢特性和生长特点等鉴定方法进行分离和鉴定。
最常用的方法是通过对分枝杆菌在特定培养基上的生长型态观察和菌落形态分析来确定其种属。
三、病原学分枝杆菌属在人类和动物中可以引起多种疾病，包括但不限于食物中毒、牲畜疾病和人类疾病。
尽管其中很多细菌是无害的或有益的，但某些菌株却可以对人类或动物健康构成威胁。
常见的分枝杆菌病原体包括：芽孢杆菌（B. anthracis）, 糖原芽胞杆菌（B. cereus），乳酸吸收性芽胞杆菌 (B. coagulans) 和枯草杆菌（B. subtilis）等。
分枝杆菌的病原性与其产生的细胞外毒素和内毒素有关，而这些毒素的分泌与生长环境和条件有很大关系。
四、工业应用除了在疾病治疗上的作用外，分枝杆菌属在工业生产中还有广泛的应用。
例如，在饮食加工业中，分枝杆菌可以用于制造豆腐、酱油等食品。
同时，分枝杆菌的一些菌株也可以进行微生物发酵生产出某些化合物，如抗生素、植酸酶、纤维蛋白溶酶等。
这些化合物在医药和普通日常生活中也被广泛使用。
五、分枝杆菌属在自然环境、医学、动物和食品加工业、以及其他工业领域都存在着广泛的应用和研究价值。
随着科学技术的发展和研究范围不断扩大，分枝杆菌属的多样性和作用将会得到更深入的了解和研究。
实验六 分枝杆菌属的鉴定
临床微生物学教研室
实验步骤及注意事项
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
石碳酸 复红 3%盐 酸酒精 吕氏 美兰
加热至出现蒸汽， 勿干，持续5min
脱色干净
复染充分 1 min
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约3 min
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初染: 在加热条件下，细胞壁通透性增加，细
菌中分枝菌酸与石碳酸复红牢固结合
脱色: 分枝菌酸复合物抵抗盐酸酒精脱色作用 复染: 组织或杂菌被吕氏美兰复染，背景呈蓝
色,结核分枝杆菌仍保持红色
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实验步骤
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
肉眼可见的菌落。
菌落:菜花样、面包屑样
临床微生物学教பைடு நூலகம்室
固体培养基上：菌落 为干燥、坚硬、表面 呈颗粒状、乳酪色或 黄色，形似菜花样， 为粗糙型。“碎面包 屑样”
液体培养内：表面生 长，形成纹状菌膜
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录像学习 结核分枝杆菌培养与诊断方法新进展（了解）
思考题 1.分枝杆菌培养标本的前处理方法？ 2.分枝杆菌快速培养系统的原理？
3+ ：1-9条/每个视野
分枝杆菌
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2、分离培养
（3）接种培养
取0.1ml处理的各种标本悬液和沉淀物，接种固体培养基 35-37℃
5%-10%CO2培养 一周内每天观察，以后每周观察一次，直到8周 根据生长时间、菌落形态、产生的色素等特点加以判定 报告方式：培养阳性 （斜面上20个菌落以下，报菌落数） 培养阴性 必须观察8周
（多用于尿标本的前处理）
胰酶-新洁尔灭：1g/L胰酶消化后，再用0.3%新洁尔灭处理5min以液化
和杀灭杂菌
NALC-2%NaOH（N-乙酰-L-半胱氨酸，2%氢氧化钠 ）适用各种标本处理
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2、分离培养
（2）培养基选择 鸡蛋为主的培养基 L-J培养基 曲氏 小川 琼脂为基础的培养基 米氏7H10和7H11 液体培养基 米氏7H9和吐温白蛋白肉汤，主要用 与药敏试验
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标本 涂片检查 分离培养 处理过的标本 或无污染标本
核酸检测
抗体检测
直接涂片
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结核分枝杆菌扫描电镜照片
L-型结核分枝杆菌扫描电镜照片
Ziehl-Neelsen 抗酸染色（痰直接涂片）
Ziehl-Neelsen 抗酸染色（纯培养）
6
金胺“O”染色，荧光显微镜下菌体发出黄绿色或橙黄色荧光
7
2、培养特性
专性需氧，8-12%CO2刺激生长，最适温度 35-37℃，
PH6.5-6.8，需要一定的湿度 生长缓慢， 18～24h分裂一代，在固体培养基上2-4周才 能长出菌落。菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄 色，表面粗糙，形似菜花样 液体培养基生长较快，多表面生长，形成菌膜，易碎沉于 管底。有毒力菌株在培养液中呈索状生长 营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及 含某些无机盐类的特殊培养基（如罗氏培养基）上才能生 长
分枝杆菌属及检验
• 全球性卫生问题
– 是艾滋病高发区人群的首要死因
• 世界防治结核病日
– 3月24日
结核分枝杆菌 －－形态染色
• 细长略弯，丝状或分 枝生长
• 无芽孢，无鞭毛，无 荚膜,无菌毛
• 革兰染色阳性，不易 着色
• 抗酸染色阳性,菌体被 染成红色
• 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～ 4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的 细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特 别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层
※液体培养基：形成菌膜， 有毒株呈索状生长
• 初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏 （Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、 甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑
制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质
生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般 2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中
教学大纲
• 掌握内容
– 结核分枝杆菌主要生物学性状；致病物质及 致病机制；结核菌素试验原理及应用；微生 物学检查法
• 了解内容
– 麻风分枝杆菌的形态染色特性、致病性及微 生物学检查法
• 全世界有1/3人口，19亿人已感染结核分枝杆 菌，15岁以下儿童感染者达1.8亿，每秒种就有一 人感染，全球有2 000万活动性患者，新发病例 1 000万人，每年有300万人死于结核，死于结核的 人数超过AIDS疾病、腹泻及热带病死亡人数的总 和，是传染病死亡最多的。近年来AIDS的发病率 上升，伴随结核病上升。我国解放前结核严重流 行，发病率大于1%，有十痨九死之称，建国后人 民生活水平提高，卫生条件的改善，抗痨药物的 发现，特别是积极开展防痨工作，接种BCG，发 病率和死亡率大大降低，但近年来有抬头趋势。
分枝杆菌属及检验考点总结
分枝杆菌属及检验考点总结一、结核分枝杆菌引起人和动物结核病的病原菌。
目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色G+，细长或略带弯曲的杆菌，在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸菌。
既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。
2.培养特性◆专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%C02环境中可刺激其生长。
需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。
◆固体培养基：2～6周才能长出菌落，呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
◆液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。
有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。
◆营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。
3.生化反应◆不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。
◆人型结核分枝杆菌：烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性；牛型结核分枝杆菌均阴性。
4.抵抗力：对酒精敏感。
5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。
毒力变异：卡介苗（BCG）——将有毒的牛型结核分枝杆菌培养。
于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。
用于预防结核病。
（二）临床意义1.致病性◆不产生内毒素和外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。
◆主要致病物质：脂质。
索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）、磷脂（形成结核结节）、硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）、蜡质D（引起迟发性过敏反应）。
◆主要通过呼吸道、消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见。
◆肺外感染可发生在脑、肾、肠及腹膜。
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分枝杆菌
1. 分枝杆菌属(Mycobacterium)：
（1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜；
（2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌；
（3）营养要求较高，常用罗琴培养基；
（4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落；
（5）G+C mol%为62%~70%；
（6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。
2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌
3. 分枝杆菌属分类
（1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌
（2）非典型分枝杆菌：
（3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌
4. 结核分枝杆菌
（1）临床意义
A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁殖导致结核发生；
B. 引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称；
C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。
D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病
（2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反应；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质；
致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引起Ⅳ型超敏反应。
（3）结核结节的形成：
A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和IV型变态反应平衡的结果；
B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。
3~6周后，细胞变形，IV型变态反应产生；
C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。
抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死；
（4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反应：
有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠10－14天，局部产生小节，形成肿块→坏死溃疡侵入附近淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。
说明初次感染，机体无免疫力和超敏反应。
在8~12周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应提早出现，2~3天内红肿硬结溃疡痊愈。
说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应。
（5）微生物学检验
标本采集: 根据病变部位不同而定(晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿)
运送: 消毒容器
直接检查: 萋-尼抗酸染色(热)、Kinyoum染色(冷)，金-胺O染色
消化: 4%NaOH 37℃15~30分钟；胰酶-新洁尔灭法；4%硫酸法（尿标本）
培养分离：罗琴培养基
鉴定: 烟酸、硝酸盐还原、触酶
药物敏感试验
（6）直接涂片染色镜检：痰厚涂片，齐-尼抗酸染色后，至少观察100个视野。
结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。
结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”。
可用计数法排除其他分支杆菌。
（7）结核分枝杆菌形态特征：①细长、略弯曲杆菌，牛型结核分枝杆菌稍短；②排列成团、成堆；；③抗酸染色阳性，治疗后菌体呈非抗酸性G+颗粒，称much颗粒（L型变异）；
④金胺“O”染色菌体呈黄色荧光；
（8）分离培养：
标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长37℃，5％~10％CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核杆菌。
鉴定：(1)PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)；
(2)DNA探针；
(3)16s rRNA基因序列测定；
(4)高效液相色谱(HPLC)检测；
（9）培养特性：
A. 最适温度35~37℃，最适pH6.4~6.8；
B. 专性需氧，在液体培养基上形成菌膜，有毒株呈索状生长；
C. 营养要求高，专嗜甘油为碳源，常用罗琴培养基(鸡蛋、甘油、枸橼酸钠、天门冬酸、马铃薯粉、孔雀绿、钾镁离子)；
D. 繁殖慢，一代需要18小时；
E. 菜花样菌落，不规则凸起、不透明、粗糙，牛型结核分枝杆菌为光滑型；
（10）生化反应：糖类发酵(-) 热触酶(-) Tween水解(-)
热触酶(-) 热磷酸酶(-)，为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定试验，后者阳性
烟酸试验(+) 硝酸盐还原(+) 中性红(+)
烟酰胺酶试验(+) 脲酶试验(+)
牛型分枝杆菌均为阴性
（11）结核分枝杆菌鉴别试验
（12）结核分枝杆菌抵抗力：
温度：菌悬液80℃5min、痰标本煮沸5min完全杀死细菌
光线：对紫外线敏感
干燥：对干燥或干热抵抗力强，干燥痰中可存活数周
化学因素：75%乙醇5min，石炭酸、来苏儿、甲醛敏感
（13）分枝杆菌属快速鉴定程序：
（14）结核分枝杆菌快速鉴定技术
A. 快速分离鉴定：采用放射性C14棕榈酸的7H12培养液，细菌生长后生成C14O2，能自动显示测定结果，有Bactec 460系统、BacT/Alert等
B. 基因检测
C. 核酸探针
D. PCR：注意假阳性的存在
E. 核酸指印技术
（15）结核菌素试验和卡介苗：
结核病是病原体和宿主相互作用，由细胞免疫介导的免疫病理反应和组织损伤的结果。
流行病学调查使用5U的OT和PPD，若1TU呈强阳性，提示有活动性的结核。
5. 麻风分枝杆菌(M.leprae)
（1）抗酸染色阳性, 短而粗, 呈束状或团状排列, 胞内寄生,胞质呈泡沫状称麻风细胞。
（2）迄今尚不能人工培养, 只能动物接种(犰狳), 也可用小鼠足垫接种, 增代时间约20~30天。
（3）麻风病：顽固性感染；瘤型：侵犯皮肤及各脏器；结核样型：自限型；界限类综合征；（4）微生物学检验：
直接镜检:组织刮片
组织病理学检查。