影响大豆子叶节再生的因素研究(1)
大豆子叶节离体再生体系优化研究
ｔ ｎ ｐ ｍｅ ｔｇ ｏ ｃ ｔｌｄ ｎ ｆｆ ｅ ｃ ｌｖ ｒ ｅ ｃ ｅ ０％ ，６ ５％ ，８１． ５％ ，７ ２ ｉ ｅ ｎａ ｅｆ ｍ ｏｙｅ ｏ ｓｏ ｉ ｕｔ ａｓｒ ａ ｈ ｄ ６ ｏ ｒ ｖ ｉ ２． ２ ７． ７％ ａ ｄ ４ ５％ ，ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ｎ ７． ｅ ｐ ｃｉｅｙ．Ｓ ｅ ｌｎ ｅ ｄｉｇ ａ ｅ ｆｏ ５ ｔ ｄ ｙ ｓｔ ｅｂ ｓ ． ｇ ｍ ｏ７ ａ ｓｗａ ｈ ｅ ｔ ｒ
大豆产量、质量的影响因素和大豆的种植技术 - 种植技术
大豆产量、质量的影响因素和大豆的种植技术-种植技术大豆的营养丰富,蛋白质、矿物质、维生素等营养物质的含量丰富。
以大豆为原料生产的饮食产品深受人们的喜爱。
大豆还具有良好的饲用价值,可作为优质的蛋白质饲料,因此要强化大豆的种植技术,提高产量。
现简单介绍大豆产量、质量的影响因素和大豆的种植技术。
1、大豆种植的意义大豆是黑龙江地区广泛种植的一种作物。
大豆的营养价值丰富，含有大量的能量、蛋白质、矿物质、维生素以及氨基酸等营养物质。
用大豆作为原料所获得的一些饮食产品可为人们提供充足的营养，因此受到人们广泛的喜爱。
其中以大豆作为原料获得的豆油可以有效防止人体患动脉硬化等疾病的几率。
因大豆中还含有丰富的维生素，因此长期食用可以避免因维生素缺乏而导致的免疫系统障碍。
大豆中的碳水化合物为蔗糖和乳糖，还可以预防糖尿病，也是糖尿病患者首选食材。
大豆除了具有良好的食用价值外，还具有很高的饲用价值，大豆在经过加工后，剩余的材料可作为畜牧养殖业的饲料，如豆饼、豆粕可作为优质的蛋白质饲料，可以促进家畜吸收蛋白质和氨基酸，提高肉类产品的营养价值。
因此，种植大豆无论是对人还是动物都意义重大。
2、影响大豆产量和质量的因素黑龙江地区的大豆种植以产量高、品质好而著名，但是在实际的种植过程中仍有诸多因素会影响到大豆种植的产量和质量。
除了一些自然因素，如温度、土壤、光照等外，还包括播种技术、施肥、田间管理以及病虫害防治等方面的原因。
其中气候对大豆的影响较大，大豆在整个生育期的气温、降水量、光照以及气温等都会直接影响到大豆营养物质的含量，通常光照充足、雨水较少、昼夜温差较大地区的大豆的品质和产量较高；不同的播种期决定了大豆的生长环境不同，会影响到大豆的生长发育和大豆籽粒中的含油量以及脂肪酸的组成，影响到大豆的品质，因此在种植大豆时要选择最适宜的播种期，做好适时播种；肥料中的一些营养素、矿物质等对大豆的产量和质量有着重要的影响作用，不同的肥料对大豆产生的影响不同，如氮肥和磷肥可增加大豆的蛋白质含量；单纯的施加有机肥会降低大豆籽粒中的含油量，当与磷钾肥和氮磷肥配合使用时则可以增加大豆中的含油量。
大豆愈伤组织诱导及再分化的影响因素探索
化,因此不同植物 对 光 照 强 度 也 有 不 同 要 求。 大 豆 在
体细胞胚胎发生诱 导 过 程 中 对 光 照 的 要 求 不 太 严 格,
可以是黑暗,也可 以 采 用 12~24h 光 照,光 照 强 度 的
[ ]
变化范围也较宽,在 50~6000l
另外,取材季节、外植体的大小与灭菌效果及存活率存
基中的生长素和细胞 分 裂 素 的 相 对 浓 度 有 关,当 生 长
在一定关联,在合适时间如生长旺季取样,试验材料的
素/细胞分裂素比值 高 时,促 进 根 的 分 化;比 值 低 时 则
消毒效果、成活率、诱导率及增殖率往往比在生长末期
促进芽的分化;而当 两 者 平 衡 时 则 会 一 直 处 于 愈 伤 组
分以及激素种类配比 选 取 不 同,大 豆 愈 伤 组 织 的 诱 导
导分化的成功率高,有 的 部 位 极 难 脱 分 化 或 再 分 化 率
以及再生也会相应呈现不同的效果。培养条件对大豆
组织培养的作用也 不 容 忽 视。 因 此,深 入 探 索 大 豆 组
很低。雷 海 英 等 [3]以 晋 豆 19 号 为 材 料,选 取 子 叶 节、
因
刘思言等 [9]以吉农 28、吉农 27、吉农 17 三个基因型大
2.
1 培养基的影响
2.
1.
1 培养基营养组分的影响
豆子叶节作为外植体进行植株再生的研究,结果表明,
培养基 是 外 植 体 赖 以 生 存 的 基 质。 培 养 基 的 种
类、营养组分以及培 养 基 的 状 态 等 也 关 系 着 组 织 培 养
关键。
导效果依次递减,说 明 胚 轴 是 比 较 适 合 的 外 植 体。 再
农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究
V ol 131,N o 12pp 1170-176 Feb 1,2005作 物 学 报ACT A AG RONOMICA SI NICA第31卷第2期2005年2月 170～176页农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究李桂兰1,2 乔亚科1 杨少辉2 靳朝霞2 李明刚2(1河北科技师范学院,河北昌黎066600;2南开大学分子生物学研究所,天津300071)摘 要:直接以农杆菌转化系统为平台,以栽培大豆(G lycine max L 1)吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30和开育12的子叶节为外植体,用LBA4404农杆菌(含pPC 2K S A 质粒)研究了影响大豆子叶节转化的因素。
结果表明,大豆品种之间转化存在着差异,吉林35转化率最高,平均转化率为2116%,单次最高转化率达6112%;中黄28次之,平均转化率为119%,单次最高转化率达3133%;南农转化率为1105%;铁丰29居第4位,转化率为0195%;铁丰30和开育12无转化植株。
用4d 苗龄的子叶节,农杆菌浸染30min ,共培养3d 比较合适。
萌发培养基和不定芽诱导培养基对转化率的影响存在交互作用,对于吉林35来说,大豆萌发培养基(G )和不定芽诱导培养基(Y )的最佳组配方式为G 2+Y 1(转化率6112%)和G 1+Y 2组合(转化率5126%)。
农杆菌介导的转化系统中,转化植株的筛选方式对转化率影响很大,筛选培养初期,采用比较低的筛选浓度,在继代培养过程中逐次提高筛选压力,可以获得较好的转化效果。
关键词:大豆;根癌农杆菌;子叶节;转化中图分类号:S565,Q78Study of the Agrobacterium 2mediated T ransformation Systems of Soybean Cotyle 2donary N odeLI G ui 2Lan 1,2,QIAO Y a 2K e 1,Y ANG Shao 2Hui 2,J IN Zhao 2X ia 2,LI M ing 2G ang 2(1H ebei Normal Univer sity o f Science &Technology ,Changli 066600,H ebei ;2Institute o f Molecular Biology ,Nankai Univer sity ,Tianjin 300071,China )Abstract :Suitable soybean genetic trans formation system has not been established by now 1The factors in fluencingAgrobacterium 2mediated soybean cotyledonary node trans formation were studied in this research so as to im prove the trans 2formation frequency of soybean 1The results showed that the trans formation frequency was different am ong cultivars of soy 2bean 1Jilin 35was the highest in trans formation rate ,Zhonghuang 28was the second and followed by Nannong and T iefeng 29,and there was no trans formed plant in T iefeng 30and K aiyu 121The average and the highest trans formation rate were 2116%and 6112%for Jilin 35,and 119%and 3133%for Zhonghuang 28,respectively (T able 1)1The suitable seedling age was about 4days 2old (Fig 15)and the appropriate duration of in fection and co 2culture with Agrobacterium were about 30m inutes and 3days respectively (Fig 14)1There was an interaction between the germ ination medium and shoots regenera 2tion medium for trans formation frequency 1The better combination pattern of germ ination medium and shoots regeneration medium were G 2+Y 1(trans formation rate was 6112%)and G 1+Y 2(trans formation rate was 5126%)in this research (Fig 16)1The screening method had a significant effect on increasing the trans formation frequency of the Agrobacterium 2me 2diated trans formation system (T able 2)1K anamycin was used as a screening agent in this study 1H igher trans formation rate was obtained by using the screening m odel S1which the kanamycin concentration increased gradually from 60mg ΠL to 100mg ΠL when subculture in the shoots regeneration stage 1It was suggested that the lower concentration of screening agent should be used in the earlier screening stage ,then the higher concentrations increased gradually in the later stages 1K ey w ords :S oybean ;Agrobacterium tumef aciens ;C otyledonary node ;T rans formation 早在1984年,Deblock 和H orsch 就进行了大豆转基因研究[1],1988年Hinchee 首先以农杆菌介导法获得大豆转基因植株[2],现在抗除草剂转基因大豆虽然已经商品化,但大豆转化的频率仍很低,重复基金项目:河北省自然科学基金(301295);国家863资助(2002AA213061);河北省科技攻关项目;河北科技师范学院博士基金。
大豆子叶节高效再生系统的研究
种为材料 ， 子叶节为外植体诱导丛生芽 ， 再生完整植株 。实验研 究了大豆种子 的消毒方 法， 因型 以及 培养过 程 中植 物激素 的浓 基 度 等影响大豆子叶节再生的 因素。结果表明在适宜的条件下 ， ４个大豆品种的丛 生芽分化率都可达 到 ９ ０％ ， 生芽数基本都在 ４ 丛
—
６个范 围内， ４个大豆 品种均为子叶节器官发生途径 的理想基 因型。最 适合的种子 灭菌方法是 双氧水 灭菌法 ； 春豆
Ｖ０． ５ １２ Ｎｏ ４ ．
西
南
农
业
学
报
１ ８１ １
Ｓ ｕ ｈ ｓ Ｃｈｎ ｏ ｒａ ｆＡ ｃ ｌ ｒｌＳ ｉｎ ｅ ｏ ｔｗｅｔ ｉａＪｕ ｎ ｌｏ ｕｔ ａ ｃｅ ｃ ｓ ｕ
文 章 编 号 ：０ １— ８９ ２ １ ）４—１８ — ６ １０ ４ ２ （０ ２ ０ １ １ ０
Ｙ Ｎ ｉＱＮ Ｊ ・ｕ ，Ａ ｎ— ，Ｕ ｕｄｎ Ａ Ｇ Ｗｅ， Ｉ ｉ ｈ ａＴ ＮＧＸｉｇｆ Ｓ Ｎ Ｚ —ｏｇ ｎ ｕ
（ ａｈＣｏ ｅｅｒｈＩｓｔｔ，Ｇ ａｇｉ ｃｄ ｍ ｆ ｇｉ ｌ ｒｌ ｃｅｃｓＧ ａｇｉ ａｎｎ ３０ ７，ｈｎ ） Ｃ ｓ ｒｐＲ ｓａ ｎｔｕｅ ｕ ｎｘ Ａ ａｅ ｙｏ ｒ ｕｔ ａ Ｓｉｎｅ ， ｕｎｘ Ｎ ｎ ｉｇ５０ ０ Ｃ ｉａ ｃ ｉ Ａ ｃ ｕ
大 豆 子 节 高 再 生 系统 的 研 究 叶 效
杨 微， 覃金 花 ， 兴 富 ， 祖 东 唐 孙
（ 广西农业科学 院经济作物研究 所 ， 广西 南宁 ５ ００ ） ３０ ７
摘
要： 为建立一个大豆子叶节高效再生体系用于大豆的遗传 转化， 以桂春豆 １号、 桂早 ２号、 桂夏 １号和桂 夏豆 ２号 ４个 大豆 品
大豆不结粒的原因
大豆不结粒的原因1、内因：品种差异、品种自身退化、引种不当（1）大豆不结实现象在品种间存在较大差异，中晚熟品种、无限结荚习性的品种，营养生长与生殖生长同时进行的时间较长，在条件适宜、氮肥偏多的情况下，常常营养生长过旺，影响光合产物向花荚转移，造成花荚脱落和秕荚。
（2）品种自身退化：大豆是自花授粉作物，天然杂交率为0.3%～1.1%,实际上，有些品种应用于生产后，初期表现较好，不长时间就严重退化，其原因有：种子没有经过提纯、自行留种进行种植以及机械混杂等因素造成品种自身退化，使大豆开花结荚量减少，诱发不实症发生。
（3）引种不当：生产上，如果对于大豆品种对光照和温度的敏感性不了解，盲目提早或者推迟播种，或者盲目异地引种，容易发生大豆不开花或只开花不结荚，或者提早开花结荚等不正常现象。
将晚熟大豆品种，作春豆提早播种，短日照条件不能按时得到满足，往往不能及时进入生殖生长阶段，在田间通常表现为：植株长得很茂盛，但是就是不开花结荚，或者开花结荚不良；将早熟春大豆作夏大豆种植，幼苗生长期处在高温条件下，容易提早开花结荚。
南种北引或者东种西引，往往会因短日照条件不能得到满足，不能正常地进入生殖生长阶段，出现生育期推迟，不能正常成熟等现象；北种南引或者西种东引，则容易提早开花结荚，并因营养体过小造成产量大幅度减产。
2、外因：温度过高或过低、降雨过少或过多、栽培措施不当、营养成分缺乏或不均衡、病虫危害（1）温度过高或过低：大豆开花授粉的适宜温度为20－25℃，超过35℃雄蕊就会死亡，适宜的相对湿度为70－90%。
大豆开花结荚期间，如果碰上持续高温干旱天气，会造成植株呼吸过旺，减少干物质积累，影响大豆开花授粉，使胚株败育形成秕荚。
如果大豆生长后期遇到低温，影响大豆灌浆速度，同样会造成较高的空秕率。
（2）降雨过少或过多：大豆播种期如遇上干旱少雨的气候，造成推迟播种，使出苗期延后，减少大豆生育期间能量的积累，会造成大豆秕粒不实。
影响大豆子叶节再生的因素研究
２ 结果 与分析
２１ 种 子 的消毒 方法 ．
１ ． 种 子 消毒 ．１ ２
挑 选 健 康无 病 害 的 大 豆 种 子 ，采 用 以下 两 种 种子 消毒 方 法 。升 汞 消 毒 法 ，大 豆 种 子 分 别 用 洗 涤 剂 、 自来 水 、蒸 馏 水 冲洗 后 ，用 ７ ％酒 精 缓 慢 ０ 摇 动 ，０１ ．％升 汞 消 毒 ４ ２ ｉ，无 菌 水 冲 洗 ４ ５ ～ ０ｍｎ ～
数 ）１０ ￣ ０ ％为指 标 ，将 外 植 体 接 种 于芽 诱 导 培 养基 上 ，每 个 处 理 ５瓶 ，每 瓶 ６个 外植 体 ，３次重 复 。
本 文 从 大 豆 的消 毒 方 法 、激 素 配 比 、不 同外
植 体 以及 芽 的诱 导 时 间对 再 生 频 率 的影 响进 行 了
基 因工 程方 面 的教学 与研究 工作 。Ｅ ｍａｌｈ ２ １ ０ ２ ａ ｏ．ｏ ．ｎ － ｉｌｙ １ ２０ ＠ｙｈｏｃｍ ｅ ：
建议采用氯气消毒法作为大豆种子消毒的方法 。
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东
北
农
业
大
学
学
报
第３ ９卷
对北京 小 黑豆 的种 子进行 两种 不 同消毒 方法 的
比较发 现 （ １ ，氯 气 消毒 法相 对 升汞 消 毒法 能够 图 ） 显 著地 降低 污染 率 ，提 高分 化率 ，二 者 的污染 率分
别 为 １ ％和 ３ ．％。因为在 记 录数据 时将 发芽 后污 ． ５ ３ ５
次。氯气消毒法 ，在通风橱 中将种 子放于密闭的
１ ． 外植体 及培 养基 ．２ ２
胞 胚 发 生 再 生 系 统 １ 豆 不 定 芽 器 官 发 生再 生 ，大 系统 和 原 生 质体 再 生 系统 。其 中大 豆 的子 叶 节经
农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化研究
农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化研究皮照兴;廉玉利;李依娜;崔唱;杨楠【摘要】大豆遗传转化是目前研究的热点,为提高大豆遗传转化效率提供理论依据,试通过实验确立农杆菌介导大豆遗传转化条件.实验利用含有pCAMBIA3301质粒的农杆菌LBA4404对辽豆-45子叶节进行了侵染,对消毒方法、草铵膦浓度、侵染浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养时间等方面进行了优化.实验结果表明:氯气灭菌5h的二次消毒法,可在不影响种子活力的同时把污染率降低为0,确定草铵膦的选择压力为6 mg/L.同时确定辽豆-45子叶节遗传转化的最佳条件为:农杆菌侵染菌液的浓度为OD600=0.6,侵染时间为30 min,暗培养条件下共培养时间为96 h,且共培养液体培养基添加200 μmol/L的乙酰丁香酮有利于转化.经草铵膦抗性筛选、GUS组织化学染色检测、PCR检测,证实pCAMBIA3301质粒的T-DNA 已经整合进了辽豆-45基因组,共获得23株转基因大豆.【期刊名称】《辽宁师专学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(018)003【总页数】5页(P86-90)【关键词】大豆;子叶节;农杆菌介导;二次消毒;遗传转化【作者】皮照兴;廉玉利;李依娜;崔唱;杨楠【作者单位】朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000【正文语种】中文【中图分类】S565.1大豆（Glycine max）原产于中国，种植面积极其广泛，是我国重要的油料作物和经济作物之一，也是世界上食用植物油和饲用蛋白的主要来源［1］，运用遗传转化技术进行遗传改良的基因工程育种以期提高大豆单产、抗性和品质已成为大豆育种的研究热点［2、3］．建立稳定高效的大豆子叶节遗传转化体系是提高大豆遗传转化效率的基础，但针对不同基因型建立高效、稳定的遗传转化体系一直是大豆基因工程育种研究领域的难点之一［4、5］．本实验以辽豆－45子叶节为外植体，对大豆种子消毒方法、草铵膦浓度、农杆菌侵染液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度以及共培养时间等因素进行了系统的研究，以期获得高效的遗传转化及再生体系，为提高大豆遗传转化效率提供理论依据，为大豆基因工程育种奠定基础．1．1 大豆品种辽豆－45，由辽宁省农科院提供．1．2 农杆菌与质粒农杆菌菌株为LBA4404，其携带双元载体pCAMBIA3301，该质粒有CaMV35S启动的草铵膦抗性基因（Bar）和CaMV35S启动的β－葡萄糖苷酶基因（gus），由郑州大学生物工程系提供．1．3 培养基（1）萌发培养基：B5盐，B5有机物，MS铁盐，30g蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．（2）共培养培养基：1／10B5基本培养基，1．67mg／L 6－苄氨基嘌呤，0．25mg／L赤霉素，3mmol／L 2－吗啉乙磺酸，0～400μmol／L乙酰丁香酮（AS），1mmol／L亚硫酸钠，400mg／L L－半胱氨酸，1mmol／L二硫苏酮糖，30g／L蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．（3）芽诱导培养基：B5基本培养基，1．67mg／L 6－苄氨基嘌呤，3mmol／L 2－吗啉乙磺酸，250mg／L羧苄青霉素（Carb），100mg／L头孢青霉素（cef），6mg／L草铵膦（PPT），30g／L蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．（4）生根培养基：1／2MS，0．2mg／L萘乙酸，1．5mg／L吲哚丁酸，3mmol／L 2－吗啉乙磺酸，30g／L蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．2．1 大豆无菌苗的获得选取表面光滑、大小均一、饱满无病斑的大豆种子，置于250mL氯气集气瓶中（利用高锰酸钾与浓盐酸反应，向上排空气法制备氯气），分别在通风厨内灭菌0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h后，转至超净工作台将种子倒入无菌培养皿中，放置1h吹走大豆表面残余的氯气，再将种子转入5%（m／V）的NaClO中浸泡2min，用无菌水冲洗3～4次，然后将种子接种于MS培养基中．种子的萌发条件为：温度25±0．5℃，光周期为16h／d，光照强度2000lx．种子萌发7d 后统计萌发率和污染率．2．2 草铵膦筛选剂浓度的确定在芽诱导培养基中添加PPT浓度分别为0、2、4、6、8mg／L．将子叶节插入芽诱导筛选培养基，培养条件与2．1相同，观察子叶节的生长状况，确定合适的PPT筛选浓度［6～8］．2．3 农杆菌侵染液制备以YEP培养基（100mg／L利福平＋100mg／L卡那霉素＋100mg／L链霉素）培养农杆菌OD600＝0．5～0．6，在4℃，5000r／min离心10min，收集菌体，将其重新悬浮于共培养液体培养基．2．4 大豆子叶节的遗传转化去掉种皮和大部分的下胚轴，只留靠近子叶3～5mm的下胚轴，将两片子叶从下胚轴中线处切开，除去顶芽和腋芽，并在子叶节点区域划伤6～8次，放置于无菌培养皿中，与用共培养液体培养基悬浮的农杆菌侵染，农杆菌侵染液浓度OD600分别为0．2、0．4、0．6、0．8、1．0，侵染时间为10、20、30、40、50min，然后用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下放置在乙酰丁香酮浓度分别为0、100、200、300、400μmol／L的共培养液体培养基中黑暗培养，培养时间为24、48、72、96、120、144h．共培养后的子叶节先用无菌水清洗3次，再用不添加琼脂的液体芽诱导培养洗涤2次，清除过度繁殖的农杆菌菌体，用灭菌滤纸吸干后转移到芽诱导筛选培养基中培养（每瓶10个子叶节，每组实验8瓶），培养条件为25±0．5℃，16h／d光照，光照强度2 000lx，两周继代一次，30d时统计芽再生情况，并计算抗性芽再生率．2．5 抗性芽的生根、移栽经芽诱导培养基培养，长出的抗性芽生长至长度约为3～5cm时，切下抗性牙移入生根培养基诱导生根．生根7d后，将其移出组培室，置于室温培养3d；去掉组培瓶上盖，于室温放置5d后移栽，遮荫培养7d．2．6 抗性植株的检测2．6．1 GUS组织化学染色检测取抗性植株和未处理植株（阴性对照）的大豆叶片经90%丙酮中固定20min后，将叶片置于20μL GUS反应液中37℃恒温过夜，随后将染色的叶片在70%乙醇中停止反应并脱去叶绿素，观察叶片的染色情况并拍照［9］．2．6．2 抗性植株的PCR检测采用CTAB法提取GUS染色呈阳性的植株和未处理植株（阴性对照）叶片DNA ［10］，进行PCR扩增，扩增采用Bar基因的引物，可扩增出750bp的产物．反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测．PCR引物为：Bar－F，5′－CGAGTCTACCATGAGCCCAGAACGACGCC－3′；Bar－R，5′－GAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAG－3′．PCR扩增程序为：94℃5min，94℃60s，53℃30s，72℃60s，35个循环，72℃10min．3．1 消毒方法对污染率及种子萌发率的影响本文采用氯气和次氯酸钠二次消毒的方法对大豆种子进行消毒．实验结果表明：随着氯气灭菌时间的增加，种子的萌发率呈不变至逐渐下降趋势，污染率显著降低，灭菌5h时种子的萌发率高达95%，污染率为0，因此本实验氯气的灭菌时间采用5h．这主要是因为氯气与种子接触时间长，易渗入种子内部，能杀死更多的病原微生物，而在消毒完毕后，种子内部的气体又迅速释放，对种子活力的影响较小，而二次消毒可清除种子表面顽固的病原体以保证无菌苗的获得．3．2 子叶节外植体芽再生过程中PPT浓度的确定表1实验结果表明，子叶节接种于芽诱导筛选培养基培养10d后，除PPT浓度为0mg／L的芽诱导培养基上的子叶节依然鲜活并产生再生芽点，其余培养基上子叶节分化均受到不同程度的影响．当PPT浓度达到6mg／L时，芽诱导培养基上的子叶节基本全部死亡，因此本实验用PPT浓度为6mg／L作为最终的筛选选择压．3．3 遗传转化条件的优化3．3．1 农杆菌侵染液浓度的优化为了便于后期实验除菌，以达到最大的转化效率且以菌液浓度最小为原则，本实验对侵染子叶节的农杆菌菌液浓度进行了优化．本实验选定侵染时间为35min，共培养时乙酰丁香酮浓度为200μmol／L，暗培养时间96h为转化条件，农杆菌侵染液浓度OD600分别为0．2、0．4、0．6、0．8、1．0．由表2可知，当农杆菌侵染液浓度OD600＝0．6～0．8时，抗性芽再生率最高，且差异不大，当OD600＜0．6时，由于农杆菌菌液侵染能力不足，导致抗性芽再生率不高，而当OD600＞0．8时，高浓度的农杆菌菌液对芽的诱导有抑制作用，使抗性芽再生率降低，所以本实验采用的农杆菌侵染液浓度为OD600＝0．6．3．3．2 农杆菌侵染时间的优化选定农杆菌侵染菌液浓度为OD600＝0．6，共培养时乙酰丁香酮浓度为200μmol／L，暗培养时间96h为转化条件，侵染时间为10、20、30、40、50min．由表3可知，侵染30min处理抗性丛生芽诱导率高达68．8%，侵染时间过长或过短均不利于抗性芽的诱导，因此确定农杆菌的侵染时间为30min．3．3．3 共培养基乙酰丁香酮浓度的优化选定农杆菌侵染菌液浓度为OD600＝0．6，侵染时间为30min，暗室共培养时间96h为转化条件，共培养时乙酰丁香酮浓度分别为0、100、200、300、400μmol／L．由表4可知，在共培养液体培养基中添加乙酰丁香酮，可显著提高抗性芽的再生率，说明分类物质能激活农杆菌的侵染活力，乙酰丁香酮浓度为200μmol／L时诱导转化的效果最佳，但乙酰丁香酮浓度过高亦会抑制转化效率．3．3．4 共培养时间的优化选定农杆菌侵染菌液浓度为OD600＝0．6，侵染时间为30min，共培养时乙酰丁香酮浓度200μmol／L为转化条件，共培养时间为24、48、72、96、120、144h．实验结果由表5可知，随着共培养时间的增加，抗性芽的再生率随之增加，但共培养96h后，抗性芽的再生率不再明显增加，且随着共培养时间的增加子叶节周围农杆菌生长量亦增加，导致实验后期去除农杆菌困难．因此确定实验的共培养时间为96h．3．4 PPT抗性植株的获得大豆子叶节外植体经农杆菌侵染30min，暗室共培养96h后，转入含PPT 6mg／L芽诱导培养基上进行筛选培养，10d后大多数子叶节萎蔫变白，只有部分子叶节切口处长出少量愈伤组织并分化出芽点，长出小芽．当小芽长到3～5cm高时转置于生根培养基中进行生根，最终获得35株具有草铵膦抗性的植株．3．5 转基因植株的检测3．5．1 GUS组织化学染色检测如图1实验结果显示，有23株抗性植株的叶片经GUS组织化学染色染成蓝色，而未经过转化处理的对照植株叶片无显色反应．表明携带gus报告基因pCAMBIA3301质粒的T－DNA已经整合进大豆基因组，并且能够正常表达．3．5．2 抗性植株的PCR检测如图2，PCR检测结果表明，阴性对照没有扩增出Bar基因片段，而GUS组织化学染色呈阳性的植株和pCAMBIA3301阳性对照均能够扩增出750bp的Bar基因片段，再次证实外源基因已经整合到大豆基因组中．本实验以前人对农杆菌介导的大豆和其他作物遗传转化经验为基础，研究了农杆菌介导辽豆－45大豆遗传转化的影响因素，并成功地将pCAMBIA3301质粒的T－DNA导入了辽豆－45基因组，证实了辽豆－45适用于农杆菌介导的遗传转化研究，属于易感基因型．本实验二次消毒法灭菌采用高锰酸钾与浓盐酸混合代替次氯酸钠与浓盐酸混合制备氯气，使灭菌时间从14～18h［11、12］降至5h，种子的萌发率高达95%，污染率为0．这种灭菌方法既保持了种子的活力，降低了种子污染率，又缩短了实验时间，节省了劳动成本．良好的侵染方法是大豆遗传转化的关键，决定转化率的高低．本实验对农杆菌侵染菌液、侵染时间、共培养液体培养基中乙酰丁香酮的浓度、共培养时间四个遗传转化参数进行了优化．实验结果表明：农杆菌侵染菌液的浓度为OD600＝0．6，若农杆菌侵染液浓度过低，与外植体接触的农杆菌细胞数目就少，则不能实现高效转化；而农杆菌侵染液浓度过高，农杆菌细胞之间发生相互抑制使其难以转化；侵染时间和黑暗培养条件下共培养时间分别为30min和96h，这两个因素直接影响了质粒T－DNA向受体细胞转移的几率，若这两个时间过长将影响细胞的呼吸作用使转化率降低，且后期实验抑菌困难；酚类物质积累量不足则难以激活农杆菌的活力，导致农杆菌介导植物遗传转化效率低下，而乙酰丁香酮可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合，实验研究发现抗性芽再生率随乙酰丁香酮浓度的升高呈先增后减趋势，在200μmol／L时诱导转化效果最佳．上述实验结果与刘晨光［13］、翟锐［11］、贾钰莹［14］等的研究结果基本一致．本实验的抗性植株经GUS组织化学染色和PCR分析，证实pCAMBIA3301质粒的T－DNA已成功整合进大豆基因组，至于其能否稳定遗传表达以及是否存在嵌合现象还有待进一步研究．［1］Stacey G，Vodkin L，Parrott W A，et al．National science foundation－sponsored workshop report．Draft plan for soybean genomics［J］．Plant Physiol，2004，135（1）：59－70．［2］杨春燕，姚利波，刘兵强，等．国内外大豆品质育种研究方法与最新进展［J］．华北农学报，2009，24（增刊）：75－78．［3］Hartman G L，West E D，Herman T K．Crops that feed the World 2．Soybean－worldwide production，use，and constraints caused by pathogens and pests［J］．Food Security，2011，3（1）：5－17．［4］段莹莹，赵琳，陈李淼，等．农杆菌介导的大豆子叶节和下胚轴转化方法的比较及优化［J］．大豆科学，2010，29（4）：590－597．［5］刘海坤，卫志明．大豆遗传转化研究进展［J］．植物生理与分子生物学学报，2005，31（2）：126－134．［6］邱波，王志坤，孟凡立，等．不同大豆基因型再生性及对农杆菌敏感性的研究［J］．大豆科学，2011，30（5）：752－756．［7］刘清醒．农杆菌介导的GsPHD2基因对大豆的遗传转化研究［D］．哈尔滨：哈尔滨师范大学，2013．［8］李鹏，张磊，胡琳，等．小麦遗传转化中优良受体基因型及L－PPT适宜浓度的筛选［J］．麦类作物学报，2008，28（2）：193－196．［9］王利华．gus基因线性片段花粉管通道法转化大豆的研究［D］．大连：大连理工大学，2004．［10］王月月，范龙，张洁，等．大豆不同生长时期基因组DNA提取方法的优化［J］．中国农学通报，2013，29（36）：319－325．［11］翟锐，高乐，丁雪妮，等．农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化［J］．大豆科学，2015，34（5）：768－774．［12］王芳娟．耐盐转基因大豆遗传转化体系的建立［D］．秦皇岛：河北科技师范学院，2013．［13］刘晨光，董秋平，乔亚科，等．农杆菌介导大豆遗传转化优化的初步研究［J］．河北农业大学学报，2016，（2）：126－130．［14］贾钰莹，蒋滢，赵强，等．农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究［J］．大豆科学，2014，33（5）：634－637．。
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２．１ 种子的消毒方法 对北京小黑豆的种子进行两种不同消毒方法的
比较发现（图 １），氯气消毒法相对升汞消毒法能够 显著地降低污染率，提高分化率，二者的污染率分 别为 １．５％和 ３３．５％。因为在记录数据时将发芽后污 染的种子也一并计算在内，升汞消毒法中分化率也 较高。在保持高分化率的前提下，将大豆种子的污 染率降到最低，是大量获得无菌苗的基础，也是大 豆组织培养能够正常、顺利进行的前提条件。因此， 建议采用氯气消毒法作为大豆种子消毒的方法。
关键词：大豆；子叶节；茎尖；激素；再生
中图分类号：Ｓ５６５．１；Ｓ５／５９｜０３５．３｜
文献标识码：Ａ
大豆转基因的研究离不开大豆高效再生系统 的建立。大豆再生系统已多有报道，如大豆体细 胞 胚 发 生 再 生 系 统 ［１－ ２］， 大 豆 不 定 芽 器 官 发 生 再 生 系统和原生质体再生系统。其中大豆的子叶节经 器官发生途径诱导丛生芽再生植株，具有取材不 受季节限制、生长快、不易发生变异、再生植株 健壮等优点。尽管以子叶节为外植体作遗传转化 时会出现嵌合体，但目前仍被认为是用于遗传转 化较好的外植体。
３０５
９６．１
３１１
７５．５
当子叶节平置于培养基上时，子叶节的分化率 比垂直半埋于培养基上低，平放时的分化率是 ７０．０％，垂直半埋的分化率是 ８６．７％。但平放时， 子叶节切段表现为生理极性现象，即在子叶节处长 出芽后，在另一端逐渐分化出不定根，而且分化出 的不定芽能在 ３ 个月内始终保持浓绿色，而当子叶 节垂直放在培养基上时，其下端只是膨胀，没有分 化出不定根，若在 ３ 周内不及时转移培养基，则不 定芽逐渐变黄枯萎。采取垂直半埋这种放置方式有 利于子叶节的分化。 ２．３ ６－ ＢＡ 和 ２， ４－ Ｄ 对子叶节不定芽的影响
［参考文献］
［ １ ］ 王晓春， 刘尚前， 王罡， 等． 大豆体细胞胚再生植株的研究［Ｊ］． 大 豆科学， ２００６， ２５（２）： １４９－ １５２．
干燥器内，混合 ９６ ｍＬ ５％次氯酸钠和 ４ ｍＬ １２Ｎ 盐酸于反应液容器中，消毒 ８￣２４ ｈ 后用无菌水浸 泡。待种子充分吸水，种皮软化后接种于萌发培养 基上。每种方法处理 １００ 粒种子，２ 次重复。 １．２．２ 外植体及培养基
取发芽生长 ４￣９ ｄ 的无菌苗切取胚轴、子叶节 接种在萌发培养基上［３］。萌发培养基的基本培养基 为 Ｂ５ 盐（Ｂ５ 培养基的大量元素和微量元素），ＭＳ－ Ｃ （ＭＳ 培养基的铁盐），Ｂ５－ Ｄ（Ｂ５ 培养基的有机物）， ３％蔗糖，０．８％琼脂粉，ｐＨ 调至 ５．８，在基本培养基 上附加不同浓度的 ６－ ＢＡ 和 ２， ４－ Ｄ，分别设 ５ 个浓 度，以分化率＝（有芽分化的外植体数／接种的外植体 数）×１００％为指标，将外植体接种于芽诱导培养基 上，每个处理 ５ 瓶，每瓶 ６ 个外植体，３ 次重复。 １４ ｄ 后统计每个处理的分化率和每个外植体芽数， 探讨 ６－ ＢＡ 和 ２， ４－ Ｄ 对丛生芽诱导的影响。
ａｎｄ ｃｈｌｏｒ ｉｎｅ ｇａｓ
垂直半埋
Ｕｐｒｉｇｒｔｎｅｓｓ
３０
ｈａｌｆ－ ｂｕｒｙｉｎｇ
２６
８６．７
２．２ 大豆外植体的选择 ６－ ＢＡ 在 ０．５、１．０、２．０、４．０ ｍｇ·Ｌ－１ 四个浓度
下，对子叶节和胚轴的分化率进行比较。子叶节随 着 ６－ ＢＡ 浓度的增加，分化率也逐渐增大，当 ６－ ＢＡ 在 ２．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时分化率最大为 ９４．３％，但随着 ６－ ＢＡ 浓度的继续增加，子叶节的分化率不增加反 而下降为 ７０．２％。同样胚轴也随着浓度的增加，分 化率逐渐增加，但当 ６－ ＢＡ 在 ２．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时分化率 最大为 ９６．１％。由表 １ 可知，子叶节与胚轴的分化 率差别不大，子叶节和胚轴都可作为大豆再生体系 的外植体。
６－ ＢＡ 的浓度范围是 ０￣５．０ ｍｇ·Ｌ－１ 如表 ３ 所示。
表 ３ 不同浓度 ６－ ＢＡ 对子叶节形成不定芽的影响 Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒ ａｔｉｏｎｓ ｏｆ ６－ ＢＡ ｏｎ
ｓｈｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒ ｏｍ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒ ｙ ｎｏｄｅｓ
子叶节不同的放置方式影响外植体的分化。结 果见表 ２。
表 １ 不同外植体对分化率的影响 Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｉａｔｉｏｎ
外植体 Ｅｘｐｌａｎｔ
６－ ＢＡ 浓度 （ｍｇ·Ｌ－ １） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
６－ ＢＡ
第 ３９ 卷 第 ３ 期 ２００８ 年 ３ 月 文章编号 １００５－ ９３６９（２００８）０３－ ０００５－ ０４
东北农业大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
影响大豆子叶节再生的因素研究
３９（３）： ５￣８ Ｍａｒ． ２００８
李海燕，武小霞，韩英鹏，刘 淼
２．４ 诱导时间对出芽率的影响 如表 ５ 所示，在 Ｂ５ ＋１．０ ｍｇ·Ｌ－１ ６－ ＢＡ 诱导培
养基上摆放外植体。不同的诱导时间，对苗的出芽 率有明显的影响。随着时间的延长，出芽率增大。 当诱导时间为 ５ ｄ 时，出芽率较高。随着时间的延 长，出芽率没有明显的变化。为了节省试验时间， 需要在最短的时间内挑选出试验材料，所以，建议 在第五天把材料取出，进行下一步试验。
６－ ＢＡ
外植体数（个） Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ
出芽率（％） Ｓｈｏｏｔ ｒａｔｅ
平均外植体 成苗数（个） Ｍｅａｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｈｏｏｔ
０
２９
１０．１
０．２３
０．５
３１
５５．４
１．２３
１．０
３２
７１．０
１．５９
２．０
３０
７９．４
２．４１
４．０
２９
８０．０
２．３５
５．０
３０
７５．３
·６·
东北农业大学学报
第 ３９ 卷
升汞（ｍｉｎ）Ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
表 ２ 子叶节不同放置方式对芽诱导的影响 Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔ ｗａｙｓ ｏｆ ｐｌａｃｅ ｏｎ
ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ
放置方式 Ｔｈｅ ｗａｙ ｏｆ
ｐｌａｃｅ
接种数（个） Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
２．０
３３
８８．５
３．４７
４．０
２９
８７．３
３．８５
５．０
３０
７５．４
２．６８
第３期
李海燕等：影响大豆子叶节再生因素的研究
·７·
其中 ６－ ＢＡ 在 １．０￣５．０ ｍｇ·Ｌ－１ 浓度范围内，子 叶节的出芽率较高，当 ６－ ＢＡ 为 ２．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时最 高，但外植体的平均成苗数没有在 ６－ ＢＡ 为 １．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时多。综合比较后，６－ ＢＡ 为 １．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时 对子叶节形成不定芽效果最好。如表 ４ 所示，２， ４－ Ｄ 在 ０．０、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０ ｍｇ·Ｌ－１ 五个浓 度范围进行比较。２， ４－ Ｄ 为 ４．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时，出芽率 最高，而 ２， ４－ Ｄ 为 ２．０ ｍｇ·Ｌ－１ 时，外植体成苗数 最高。比较后选择 ２， ４－ Ｄ 为 ２．０ ｍｇ·Ｌ－１ 作为最佳 浓度。并且在加 ６－ ＢＡ 和 ２， ４－ Ｄ 的培养基中的幼苗 比较粗壮，不加 ６－ ＢＡ 和 ２， ４－ Ｄ 的培养基大豆幼苗 细且出现大量弯曲，加入的 ６－ ＢＡ 和 ２， ４－ Ｄ 的培养 基比不加的培养基在出芽数上有明显的区别［４］。其 中 １．０ ｍｇ·Ｌ－１ ６－ ＢＡ 和 ２．０ ｍｇ·Ｌ－１ ２， ４－ Ｄ 的效果最 好，且 ６－ ＢＡ 的出芽数是 ３．５６，２， ４－ Ｄ 的出芽数是 ２．４１。所以，建议选择 ６－ ＢＡ 作为子叶节不定芽诱 导激素［５］。
本文从大豆的消毒方法、激素配比、不同外 植体以及芽的诱导时间对再生频率的影响进行了 讨论，为建立高效稳定的大豆再生体系提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料 大豆品种北京小黑豆，由东北农业大学大豆
所提供。 １．２ 方法 １．２．１ 种子消毒
挑选健康无病害的大豆种子，采用以下两种 种子消毒方法。升汞消毒法，大豆种子分别用洗 涤剂、自来水、蒸馏水冲洗后，用 ７０％酒精缓慢 摇动，０．１％升汞消毒 ４～２０ ｍｉｎ，无菌水冲洗 ４￣５ 次。氯气消毒法，在通风橱中将种子放于密闭的
表 ４ 不同浓度 ２， ４－ Ｄ 对子叶节形成不定芽的影响 Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒ ａｔｉｏｎｓ ｏｆ ２， ４－ Ｄ ｏｎ
ｓｈｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒ ｏｍ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒ ｙ ｎｏｄｅｓ
６－ ＢＡ 浓度 （ｍｇ·Ｌ－ １） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
６－ ＢＡ 浓度 （ｍｇ·Ｌ－ １） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
６－ ＢＡ
外植体数（个） Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ
出芽率（％） Ｓｈｏｏｔ ｒａｔｅ
平均外植体 成苗数（个） Ｍｅａｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｈｏｏｔ
０
３０
１５．０
０．４９
０．５
３１
７４．６
１．６７
１．０
３２
８６．７
３．５６
接种外植体数 （个）
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ
分化率（％） Ｐｅｒ． ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
０．５
子叶节
１．０
Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ
ｎｏｄｅ
２．０
４．０
０．５
胚轴
１．０
Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
２．０
４．０