人核因子kb受体活化因子配体RANKL试剂盒说明书
RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表达在牙龈癌中临床意义
㊀㊀基金项目:国家自然科学基金资助项目(81500893)作者单位:222002㊀徐州医科大学附属连云港医院口腔科通讯作者:秦晗,主任医师,硕士生导师,电子信箱:qinhan2005@RANKL ㊁OPG ㊁NF -κBp65蛋白表达在牙龈癌中临床意义秦㊀晗㊀龚永庆㊀徐宏志摘㊀要㊀目的㊀观察牙龈癌中RANKL㊁OPG㊁NF -κBp65蛋白表达和RANKL /OPG 比值变化,初步探讨骨质破坏相关蛋白所代表的生物学行为和临床意义㊂方法㊀收集2018年7月~2019年12月笔者医院牙龈癌临床标本,采用免疫组织化学方法检测RANKL㊁OPG㊁NF -κBp65蛋白表达并分析RANKL /OPG 比值变化㊂通过Western blot 法比较体外培养的牙龈癌和牙龈上皮细胞中3种蛋白表达及RANKL /OPG 比值差异㊂结果㊀牙龈癌临床标本中,RANKL 和OPG 蛋白在细胞质中强阳性表达,NF -κBp65在细胞核中强阳性表达,对照组弱阳性表达,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05),RANKL /OPG 比值较对照组升高,差异有统计学意义(P <0.05)㊂Western blot 法结果显示,与牙龈上皮细胞比较,牙龈癌细胞中RANKL㊁OPG㊁NF -κBp65蛋白过表达,RANKL /OPG 比值升高,差异有统计学意义(P <0.05)㊂结论㊀RANKL㊁OPG 蛋白表达及RANKL /OPG 比值升高后可能通过激活NF -κBp65引起牙龈上皮细胞异常分化为牙龈癌细胞,为牙龈癌发病机制探讨及临床治疗靶点选择提供新的实验依据㊂关键词㊀牙龈癌㊀骨质破坏相关蛋白㊀临床意义中图分类号㊀R34㊀㊀㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀㊀㊀DOI ㊀10.11969/j.issn.1673-548X.2021.02.012Expression of RANKL ,OPG ,NF -κBp65Protein in Gingival Carcinoma and Its Clinical Significance.㊀Qin Han ,Gong Yongqing ,XuHongzhi.Department of Stomatology ,The Lianyungang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University ,Jiangsu 222002,ChinaAbstract ㊀Objective ㊀To detect the expression ofRANKL,OPG,NF -κBp65protein in gingival carcinoma,and to observe the change of RANKL /OPG ratio,then to investigate the biological behavior and clinical significance of bone destruction associated protein.Methods ㊀The expression of RANKL,OPG and NF -κBp65protein was detected by immunohistochemical method in the clinical speci-mens of gingival carcinoma from July 2018to December 2019,and RANKL /OPG ratio was analyzed.Western blot was used to compare the expression of three proteins in human gingival cancer cells and gingival epithelial cells,and to analyze the RANKL /OPG ratio.ResultsIn the clinical specimens of gingival carcinoma,RANKL and OPG were strongly positive in the cytoplasm,NF -κBp65was strongly posi-tive in the nuclei.The control group was weakly positive by immunohistochemical pared with the control group,the experi-mental group had statistical significance(P <0.05).The ratio of RANKL /OPG was significantly higher than that of control group (P <0.05).Western blot analysis showed that RANKL,OPG,NF -κBp65protein overexpression and RANKL /OPG ratio was significantly higher in gingival cancer cells than in gingival epithelial cells,the results were statistically significant (P <0.05).Conclusion ㊀The in-creased expression of RANKL,OPG and RANKL /OPG ratio may induce abnormal differentiation of gingival epithelial cells into gingival cancer cells by activating NF -κBp65,which provides a new experimental basis for the study of the pathogenesis of gingival cancer and theselection of clinical therapeutic targets.Key words ㊀Gingival carcinoma;Bone destruction associated protein;Clinical significance㊀㊀牙龈癌发生率高且易早期侵犯颌骨引起骨质破坏,目前主要以手术切除为主配合放化疗,治疗效果欠佳[1]㊂近年发展起来的靶向治疗因在多种肿瘤中疗效显著已使其成为新的有效治疗手段[2]㊂研究牙龈癌发生过程中分子机制,寻找有效治疗靶点,对于牙龈癌的彻底治疗具有重要意义㊂核因子-κB 受体活化因子配体(RANKL)属于肿瘤坏死因子超家族成员,通过与核因子-κB 受体活化因子(RANK)结合,促进破骨细胞分化成熟,发挥骨吸收作用㊂骨保护蛋白(OPG )是诱饵受体,与RANKL 结合后可阻断RANKL /RANK 结合[3,4]㊂局部微环境中RANKL 和OPG 表达的相对水平即RANKL /OPG 比值是决定破骨细胞形成和活性的关键,若比值升高,则破骨细胞形成活跃,反之则破骨细胞形成受抑[5]㊂㊃84㊃近年来RANKL与肿瘤之间关系引发关注,研究表明,大多数肿瘤细胞中RANKL处于持续性激活状态,抑制RANKL可阻止肿瘤生长和肿瘤转移引起的骨质破坏,因此认为RANKL与肿瘤的发生㊁分化㊁侵袭和转移密切相关,可作为肿瘤诊断标志物和有效治疗靶点[6]㊂NF-κB是重要转录因子,主要以p65/ p50二聚体形式与抑制因子(I-κB)绑定并长期处于细胞质中㊂当细胞膜受体相应配体刺激后,I-κB激酶通过泛素-蛋白酶体通路介导I-κB复杂磷酸化,使p65/p50二聚体被释放进入细胞核,从而启动对目标基因的转录[7,8]㊂NF-κBp65参与NF-κB通路激活的经典和非经典通路中,被视为NF-κB通路激活的重要证据㊂本研究将RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白和RANKL/OPG比值变化作为研究对象,以期揭示牙龈癌的发生可能与RANKL过表达后激活NF-κBp65,进而通过NF-κB通路正反馈机制引起牙龈上皮细胞异常分化相关㊂材料与方法1.主要材料:牙龈癌临床标本(徐州医科大学附属连云港医院)㊁牙龈癌和牙龈上皮细胞系(中国科学院上海细胞库)㊁胎牛血清(上海威正翔禹生物科技有限公司)㊁免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)㊁BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)㊁蛋白质预染标志物(上海赛默飞世尔有限公司)㊁ECL-PLUS试剂盒(上海赛默飞世尔有限公司)㊁SDS-PAGE蛋白电泳仪(上海天能科技有限公司)㊁蛋白转膜仪(上海天能科技有限公司)㊁离心机(上海赛默飞世尔有限公司)㊁倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)㊁生物安全柜(上海振样创科技有限公司)㊁CO2培养箱(日本三洋贸易株式会社)㊂2.免疫组化检测临床标本:收集2018年7月~ 2019年12月笔者医院诊治的牙龈癌标本,制备组织切片,脱蜡至水,染色前60ħ放置1h㊂按试剂盒说明进行免疫组化染色,分别加入RANKL[小鼠,美国Proteintech公司,66610-1-Ig,1ʒ500,(35~ 38)kDa]㊁OPG(兔,英国Abcam公司,ab9986,1ʒ500, 56kDa)㊁NF-κBp65(兔,美国CST公司,#8242, 1ʒ100,65kDa)多克隆抗体,4ħ冰箱过夜,标本彻底清洗后加入稀释好的兔抗或鼠抗IgG抗体(兔,美国CST公司,#7074,1ʒ2000,小鼠,#7076,1ʒ2000)孵育30min㊂苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白表达并分析RANKL/OPG比值㊂3.牙龈癌细胞和牙龈上皮细胞培养:从液氮罐中取出购自中国科学院上海细胞库的人牙龈癌细胞和牙龈上皮细胞冻存管,完全解冻后,1300r/min,离心3min㊂而后吸去上清,加入MEM培养基重悬细胞,晃匀后置于37ħ㊁5%CO2培养箱进行细胞培养㊂24h后更换培养液,待细胞汇合度达80%左右传代㊂继续培养至细胞对数生长期时,用胰蛋白酶消化制成(3~5)ˑ104个/毫升单细胞悬液,以2ˑ104/cm2的密度接种到相应培养板,继续培养24h㊂4.Western blot法检测RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白表达:收集牙龈癌和牙龈上皮细胞,PBS洗涤, 2ˑLysis Buffer裂解,4ħ㊁12000r/min㊁离心15min,而后取上清,BCA法测定蛋白浓度㊂根据目的蛋白大小配制不同浓度胶,采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶法进行电泳㊂电泳结束后,使用转移电泳装置, 4ħ㊁300mA恒流电转150min,将蛋白转移到PVDF 膜上㊂分别将稀释好的RANKL(1ʒ2000)㊁OPG(1ʒ2000)㊁NF-κBp65(1ʒ500)多克隆抗体(厂家批号同免疫组化)与封闭好的PVDF膜孵育过夜㊂彻底清洗后再将稀释好的兔抗或鼠抗IgG(1ʒ2000)抗体(厂家批号同免疫组化)与PVDF膜孵育1.5h㊂再次清洗PVDF膜后X线显影㊁定影㊁晾干㊁结果分析㊂内参为GAPDH(小鼠,上海SANTA CRUZ生物技术有限公司,sc-32233,1ʒ2000,36kDa)㊂5.统计学方法:应用SPSS19.0统计学软件对实验组和对照组数据进行t检验,以P<0.05为差异有统计学意义㊂结㊀㊀果1.免疫组化结果:分别在实验组牙龈癌细胞核和细胞质中见到棕色沉淀分布,RANKL㊁OPG在细胞质中强阳性表达,NF-κBp65在细胞核中强阳性表达㊂对照组免疫组化染色弱阳性(图1)㊂与对照组比较, RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白表达及RANKL/OPG 比值升高,差异有统计学意义(P<0.05,图2㊁图3)㊂2.Western blot法检测结果:与对照组比较,实验组RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白表达均升高(图4)㊂与对照组比较,RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白表达及RANKL/OPG比值升高,差异有统计学意义(P<0.05,图5㊁图6)㊂讨㊀㊀论RANKL是肿瘤坏死因子超家族成员,存在膜结合和分泌型两种形式,可与破骨前体细胞RANK相结合,诱导破骨细胞成熟㊂以往研究认为,RANKL参㊃94㊃图1㊀免疫组化法检测牙龈癌蛋白表达(ˑ200)A.实验组RANKL 染色;B.对照组RANKL 染色;C.实验组OPG 染色;D.对照组OPG 染色;E.实验组NF -κBp65染色;F.对照组NF -κBp65染色图2㊀免疫组化检测牙龈癌蛋白表达统计学分析㊀图3㊀免疫组化法检测RANKL /OPG 蛋白比值统计学分析㊀与骨代谢㊁免疫㊁心血管等多种生理病理过程,近年来RANKL 与肿瘤间关系越发受到重视[9,10]㊂大量研究表明,大多数肿瘤细胞中RANKL处于持续性激活状图4㊀Western blot 法检测牙龈癌细胞RANKL ㊁OPG ㊁NF -κBp65蛋白表达结果A.RANKL;B.OPG;C.NF -κBp65;D.内参;1㊁3㊁5为对照组,2㊁4㊁6为实验组㊀图5㊀Western blot 法检测牙龈癌细胞RANKL ㊁OPG ㊁NF -κBp65蛋白表达统计学分析㊀图6㊀Western blot 法检测RANKL /OPG蛋白比值统计学分析㊀态,因此认为RANKL 与肿瘤发生㊁发展密切相关,这将为相关疾病治疗提供新的思路和方法㊂通过对多发性骨髓瘤研究发现,在骨髓瘤细胞和骨髓间质细胞内均可见RANKL 表达升高[11]㊂乳腺癌研究中提示RANKL 升高可能与乳腺癌细胞表达或诱导多种促进骨代谢因子,致使骨髓基质细胞大量产生RANKL 有㊃05㊃关[12]㊂通过临床标本和体外培养的牙龈癌细胞研究显示,牙龈癌细胞中RANKL表达较对照组明显升高,提示同大多数肿瘤一样,牙龈癌中RANKL也处于激活状态,这为本研究的最初设想即将RANKL作为牙龈癌的治疗靶点提供有效的实验依据㊂OPG作为诱饵受体,主要功能是抑制破骨细胞分化㊁成熟,并诱导其凋亡㊂作用机制为直接抑制RANK/RANKL复合体活性,或者通过与RANK竞争性结合RANKL,间接抑制骨吸收以及OPG独立于RANKL直接抑制破骨细胞活性,抑制骨吸收[13,14]㊂人体内骨代谢平衡或失调更多取决于RANKL/OPG 比值,而不是RANKL或OPG绝对含量值,比值降低,破骨细胞分化和活性降低,反之则升高㊂介于RANKL和OPG相互拮抗作用,因此观察RANKL/ OPG比值变化较单独观察RANKL和OPG变化更有意义[15]㊂本研究对临床标本和体外培养牙龈癌细胞中OPG蛋白检测发现,与对照组比较,实验组OPG 蛋白表达升高,但牙龈癌中RANKL/OPG比值仍高于对照组㊂此结果提示当RANKL和OPG表达量均升高而骨吸收没有被相应抑制时,可能是因为牙龈癌细胞中RANKL表达远远高于OPG的表达,即RANKL/ OPG比值增加的缘故㊂NF-κB调节免疫球蛋白κ轻链在B淋巴细胞中的表达,若失调易导致各种恶性肿瘤发生,因此,很多研究着力于探索实体瘤中NF-κB表达的临床意义,以提示疾病预后[16]㊂NF-κB主要以p65/p50二聚体形式存在于细胞内,未激活时,NF-κB与I-κB 结合,存在于细胞质中,若受到细胞膜外信号刺激, I-κB激酶复合体将I-κB磷酸化,使NF-κB暴露核定位点㊂游离的NF-κB迅速移位到细胞核,诱导相关基因转录[17]㊂NF-κB信号通路可以被RANKL 等炎性介质激活,其活化后也可以作为外界刺激因子进一步活化NF-κB,形成NF-κB自身活化的正反馈机制[18]㊂p65参与NF-κB激活的经典和非经典通路,被视为NF-κB通路激活的重要证据[19]㊂本研究选择NF-κBp65作为牙龈癌检测指标,旨在观察NF-κBp65激活是否与局部微环境中RANKL/ OPG比值增加有关,以及NF-κB信号通路是否是牙龈癌发生的重要信号通路,进而分析靶向RANKL治疗牙龈癌时NF-κBp65表达变化与临床效果和生存的关系㊂笔者临床标本和体外培养细胞的研究结果同时提示,与正常对照组比较,牙龈癌中NF-κBp65存在过表达现象,提示局部微环境中RANKL/OPG比值增加可能导致NF-κB信号通路激活进而引起牙龈上皮细胞异常分化㊂近年来虽然牙龈癌的基础和临床诊疗方法的研究取得很大进展,但治疗效果未见显著提高[20]㊂靶向治疗是针对细胞受体㊁关键基因㊁调控分子等生物靶点进行干预,达到阻止肿瘤发生㊁发展并促进肿瘤细胞凋亡的特异性治疗,因其发展迅速㊁疗效较佳,引起众多学者关注[21]㊂因此,明确牙龈癌发生过程中调控牙龈上皮细胞异常分化的分子信号机制对于牙龈癌有效治疗靶点的选择至关重要㊂本研究通过观察RANKL㊁OPG㊁NF-κBp65蛋白表达及RANKL/ OPG比值变化,初步探讨牙龈癌细胞分化的可能调控机制,从而为寻找牙龈癌有效治疗靶点提供帮助㊂参考文献1㊀Sato K,Hayashi Y,Watanabe K,et al.Concurrent chemoradiothera-py with intravenous cisplatin and docetaxel for advanced oral cancer [J].Nagoya J Med Sci,2019,81(3):407-4142㊀Qiao M,Zhao C,Liu Q,et al.Impact of ALK variants on brain me-tastasis and treatment response in advanced NSCLC patients with on-cogenic ALK fusion[J].Transl Lung Cancer Res,2020,9(4): 1452-14633㊀Ibrahim T,Ricci M,Scarpi E,et al.RANKL:a promising circulat-ing marker for bone metastasis response[J].Oncol Lett,2016,12 (4):2970-29754㊀de Castro LF,Burke AB,Wang HD,et al.Activation of RANK/ RANKL/OPG pathway is involved in the pathophysiology of fibrous dysplasia and associated with disease burden[J].J Bone Miner Res, 2018,34(2):290-2945㊀Pitari MR,Rossi M,Amodio N,et al.Inhibition of miR-21restores RANKL/OPG ratio in multiple myeloma-derived bone marrow stro-mal cells and impairs the resorbing activity of mature osteoclasts[J]. 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小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)ELISA检测试剂盒简介
小鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）ELISA检测试剂盒简介小鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）ELISA检测试剂盒说明书检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被核因子κB受体活化因子配基（RANKL）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。
颜色的深浅和样品中的核因子κB受体活化因子配基（RANKL）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。
严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。
全部液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒构成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无停止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0S5）浓度依次为：0、12.5、25、50、100、200pg/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
rankl分子量
rankl分子量
RANKL分子量是指受体活化的核因子κB配体（RANKL）的分子质量。
RANKL是一种细胞因子，它在骨骼系统中起着重要作用。
它通过与其受体RANK结合，促进成骨细胞的形成和成熟，同时也促进破骨细胞的活化和成熟，从而调节骨骼的重塑和代谢。
RANKL分子量的测定对于研究骨骼系统的疾病和药物的研发具有重要意义。
通常来说，科研人员通过蛋白质分离和纯化的方法，利用质谱技术或者其他生物化学技术来测定RANKL的分子量。
这项工作需要精密的实验操作和高度的专业知识，但是得到的结果对于骨骼系统疾病的研究和相关药物的开发具有重要的指导意义。
在疾病研究方面，RANKL分子量的测定可以帮助科研人员了解其在骨质疏松、骨折愈合和骨肿瘤等疾病中的作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供理论依据。
在药物研发方面，RANKL分子量的测定可以帮助科研人员评估潜在药物对RANKL的影响，从而筛选出对骨骼系统疾病具有潜在疗效的药物候选物。
总的来说，RANKL分子量的测定对于骨骼系统疾病的研究和相关药物的研发具有重要意义。
通过深入了解RANKL的分子特性，科研人员可以更好地理解骨骼系统疾病的发生机制，为相关疾病的治疗和预防提供理论支持。
同时，对RANKL分子量的测定也有助于筛选出对骨骼系统疾病具有潜在疗效的药物，为相关药物的研发提供重要参考。
希望在未来的研究中，科研人员能够进一步深入地探索RANKL的作用机制，为骨骼系统疾病的治疗和预防做出更大的贡献。
腺苷酸激酶5(AK5)ELISA试剂盒说明书
腺苷酸激酶5(AK5)ELISA试剂盒说明书本试剂仅供研究使用标本：体液腺苷酸激酶5(AK5)ELISA试剂盒说明书试验原理：BFGF试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知BFGF浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将BFGF和生物素标记的抗体同时温育。
人碱性成纤维细胞生长因子ELISA 检测试剂盒洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中BFGF的浓度呈比例关系。
腺苷酸激酶5(AK5)ELISA试剂盒说明书自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1．避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
腺苷酸激酶5(AK5)ELISA试剂盒说明书操作注意事项1．试剂应按标签储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
腺苷酸激酶5(AK5)ELISA试剂盒说明书样品收集、处理及保存方法1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
人血小板活化因子(PAF)分析检测ELISA试剂盒使用说明书
人血小板活化因子（PAF）分析检测ELISA试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用Purpose目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中转化生长因子（PAF）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人血小板活化因子（PAF）水平。
用纯化的转化生长因子（PAF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入转化生长因子（PAF），再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的转化生长因子（PAF）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人血小板活化因子（PAF）浓度。
试剂盒内容及其配制：试剂盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）塑料膜板盖1块半块标准品：100ng/ml 1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）生物素标记的抗OT抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）亲和链酶素-HRP 1瓶（12ml）1瓶（5ml）洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：45μmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存自备材料：1. 蒸馏水。
核因子-κB受体及其配体信号通路在肿瘤中的表达及其研究进展
核因子-κB受体及其配体信号通路在肿瘤中的表达及其研究进展胡向阳;杜远立;陈涛【摘要】核因子-κB受体(RANK)及其配体(RANKL)在最近十几年得到广泛研究.RANK在正常细胞和肿瘤细胞中均能高频表达.RANKL在肿瘤微环境中经常被检测到,并且在骨的重塑和免疫过程中起着关键作用.研究表明RANK和RANKL共同参与了肿瘤发生发展过程的各个阶段.RANK-RANKL信号通路主要由3个因素调节,它们分别是骨保护素(OPG)、骨保护素配体和一个能够结合RANKL的膜受体(LGR4).本文以肿瘤转移为重点,探讨RANK-RANKL信号通路在肿瘤侵袭和转移中的意义以及以RANK-RANKL为靶点治疗肿瘤的相关研究进展.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2017(029)001【总页数】4页(P78-80,封3)【关键词】核因子-κB受体;配体;肿瘤;转移;机制【作者】胡向阳;杜远立;陈涛【作者单位】三峡大学医学院国家中医药管理局中药药理肿瘤科研三级实验室,湖北宜昌443002;三峡大学医学院国家中医药管理局中药药理肿瘤科研三级实验室,湖北宜昌443002;三峡大学医学院国家中医药管理局中药药理肿瘤科研三级实验室,湖北宜昌443002【正文语种】中文【中图分类】R73-3肿瘤细胞的信息传递通常依靠黏附分子与通道的物理接触实现，同时伴随大量细胞因子参与，这些因子对肿瘤细胞和肿瘤环境之间的信号传递起关键作用[1]。
在这些细胞因子家族中，核因子-κB受体(receptor activator of NF-κB，RANK)及其配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)在最近十几年得到广泛研究[2-3]。
RANK-RANKL信号通路在机体生长发育、肿瘤发生及免疫过程中具有重要作用。
对RANK-RANKL的研究已经从最初的骨骼系统发育扩展到血管形成、肿瘤发生与发展以及免疫系统功能等多个领域[3-5]。
RANKL-RANK-OPG骨调节轴
ＲＡＮＫＬ－ＲＡＮＫ－ＯＰＧ骨调节轴作者：叶超群纪树荣钟兴明来源：《首都体育学院学报》2006年第06期摘要：核因子kB受体活化因子配基(receptor activator of NF-kB Ligand,RANKL)是一种Ⅱ型跨膜蛋白，是目前发现的惟一具有诱导破骨细胞分化、发育、发挥功能的因子；NF-kB受体激活子（receptor activator of NF-kB，RANK）是一种Ⅰ型跨膜蛋白，是RANKL的惟一受体，是RANKL发挥功能的关键；骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)是一种分泌型糖蛋白，与RANKL竞争性与RANK结合抑制骨吸收、促进骨形成。
RANKL、RANK、OPG形成RANKL-RANK-OPG骨调节轴，是影响破骨细胞分化、发育、调节其功能惟一的、最终的途径，不仅在多种骨质疏松的发病中起重要作用，而且也为骨质疏松的治疗开辟了广阔的前景。
关键词： RANKL；RANK；OPG；RANKL-RANK-OPG轴中图分类号： G804.7文章编号：1009-783X(2006)06-0061-04文献标识码： A在人体骨的重塑过程中，破骨细胞是骨重塑的“启动子”，成骨细胞是骨重塑的“调节者”，核因子kB受体活化因子配基(receptor activator of NF-kB Ligand,RANKL) 是骨吸收和骨形成偶联的关键。
1997年，几个不同的研究小组分别发现了肿瘤坏死因子受体、配体超家族新成员：骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、RANKL、NF-kB受体激活子（receptor activator of NF-kB， RANK）；随后，多项研究相继显示：RANKL、OPG具有调节破骨细胞分化、发育、影响其功能的作用，RANK是RANKL、OPG发挥作用的关键，它们形成一个骨调节轴；从此骨生物学的发展进入了一个崭新的时代。
研究表明，RANKL-RANK-OPG轴是影响破骨细胞分化、发育、调节其功能惟一的、最终的途径，不仅在多种骨质疏松的发病中起重要作用，而且也为骨质疏松的治疗开辟了广阔的前景。
RANK、RANKL与人工关节磨损颗粒诱导骨溶解
RANK、RANKL与人工关节磨损颗粒诱导骨溶解陈德胜;张先龙【摘要】人工关节磨损颗粒诱导的骨溶解是人工关节置换术后无菌性松动的最主要原因.人工关节各个部件相互摩擦产生的磨损颗粒经体内巨噬细胞反复吞噬、刺激产生多种细胞因子和炎症介质.磨损颗粒与巨噬细胞相互作用产生的促炎症反应使破骨细胞过度生成和激活,人工关节周围正常骨质被吸收破坏,最终形成骨溶解和无菌性松动.研究证实,细胞核因子κB活化因子受体(RANK)及其配体(RANKL)在骨溶解中起重要作用.该文就RANK、RANKL结构,生物学功能及其与磨损颗粒诱导骨溶解的关系等近期研究进展作一综述.【期刊名称】《国际骨科学杂志》【年(卷),期】2012(033)006【总页数】3页(P398-400)【关键词】细胞核因子κB活化因子受体;细胞核因子κB活化因子受体配体;无菌性松动;磨损颗粒;骨溶解【作者】陈德胜;张先龙【作者单位】200233,上海交通大学附属第六人民医院骨科;200233,上海交通大学附属第六人民医院骨科【正文语种】中文人工关节置换术作为日趋成熟的外科技术，能达到解除患者关节疼痛、重建关节活动功能并提高生活质量的治疗目的，是晚期骨关节炎、类风湿关节炎及老年股骨颈骨折或各种原因引起的股骨头坏死终末期病变等有效的治疗方法之一。
随着手术技术和人工关节制作工艺的不断提高，组织生物工程学和材料学的进一步发展，人工关节置换术后并发症如感染、人工关节断裂下沉等明显减少。
但人工关节磨损颗粒引起的人工关节周围骨溶解导致的无菌性松动，仍然是影响人工关节长期使用的重要并发症和人工关节失败、返修的主要原因。
磨损颗粒诱导骨溶解是一复杂的病理过程，其中细胞核因子κB活化因子受体(RANK)及其配体(RANKL)起着重要的调控作用。
深入研究RANK和RANKL的调控机制及其与磨损颗粒诱导骨溶解的关系，对于研究人工关节磨损颗粒所致无菌性松动的机制并寻找积极有效的预防和治疗手段有着重要意义。
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人核因子kb受体活化因子配体（RANKL）试剂盒说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T
25 pmol/L - 800 pmol/L
使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中核因子kb受体活化因子配体（RANKL）含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人核因子kb受体活化因子配体（RANKL）水平。
用纯化的人核因子kb受体活化因子配体（RANKL）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入核因子kb受体活化因子配体（RANKL），再与HRP标记的核因子kb受体活化因子配体（RANKL）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的核因子kb受体活化因子配体（RANKL）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人核因子kb 受体活化因子配体（RANKL）浓度。
试剂盒组成
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。