第四章 工业微生物育种诱变剂

（三）紫外线诱变的步骤与方法： （1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。 （2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏 等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质， 如咖啡碱或异烟肼等。 （3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107～108ml-1， 霉菌约106 ml-1。 （4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结 束时冰浴1-2h。
2．甲基磺酸乙酯（简称EMS） 甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一 种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于 水，不稳定，易水解成无活性物质。 EMS的诱变处理方法： ①EMS母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将 需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配 制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓 冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中 易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种 类不同有所差异。 3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与 每种微生物修复系统的强弱有关。
二、辐射引起生物效应的影响因素
1．微生物的遗传背景 ：G+C% 2．微生物的生理状态 3．可见光 4．细胞水分 5．温度 尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作 用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺 氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。
烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及 磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起 突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟 嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂 起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是 鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主 要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2， 腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占 烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起 的突变仅是少数。 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂， 而造成突变。
四、移码诱变剂
移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造 成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR－171、ICR191等。移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用，诱发细 菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某 些产生抗生素的放线菌。用处理后，发现产量明显下降， 主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。
（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例） 1．单独处理 将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液， 加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8-10h，消耗其体内 的贮存物质，将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中， 处理浓度为25-40ug／ml，混合均匀．取0.1-0.2ml菌 悬液加人到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下， 使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进 行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5BU的浓度，常处理浓度为0.1mg／ml。
一、碱基类似物
用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5 －IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌 呤的结构类似物。最常用是5－BU和AP。 当将这类物质加人到培养基中，在繁殖过程中可以掺 人到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作 用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引 起突变，因此，也叫掺人诱变剂。显然这一类诱变剂要 求微生物细胞必需处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的 诱变效果。
（二）亚硝酸的处理方法 1．试剂的配制 （1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液 （2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液 以上试剂用前均要灭菌。
2．处理方法 取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液 lml，最后处理浓度为0.025 mol／L；25-26℃保温1020min，加入的磷酸氢二钠溶液20 ml，使pH下降至pH 6.8 左右，以终止反应。稀释分离于平板。 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则 会影响诱变效果。
吖啶黄的性质和使用方法： 淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚， 不稳定，见光易分解。 使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的 母液。通常处理方法是特将它们加入培养基中， 使最后浓度为10-50ug/ml，混合后制成平板，适 温培养，在生长过程中处理。另外还可将吖啶黄 加人到培养液中，浓度为10-20 ug/ml，在适温条 件下，振荡培养过程中处理。
三、非电离辐射——紫外线
（一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复 1．紫外线的诱变机制 有的是DNA与蛋白质的交联．有的是胞嘧啶与尿 嘧啶之间的水合作用，有的是DNA链的断裂，还有的是形 成嘧啶二聚体。形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。 2．DNA损伤修复 光复活 切除修复
（二）紫外线诱变 1．紫外线有效光谱 最有效的波长为253.7nm，而15w紫外灯 管放射出来的紫外线大约有80％波长集中在 253.7nm。 2．紫外线的辐射剂量 分绝对剂量erg-1/mm2和相对剂量照射时间 或者杀菌率表示 。 一般认为杀菌率以90％-99.9％效果较 好。但也有报道，认为较低的杀菌率70—80%有利 于正突变菌株的产生。
（二）烷化剂的性质 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水 溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其 长短与温度、溶液PH关系很大。因此，化学诱变剂 要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适 的缓冲液。 有毒！！！！
（三）常用的烷化剂 1、亚硝基胍（NTG） 黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄 色变为绿色时，诱变效应际低。 有超诱变剂之称，常用缓冲溶液有磷酸缓冲 液和Tri缓冲液。
经后培养的培养液．除部分进行平皿分离外。剩余的 培养液可以加人适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本 有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50％甘油 （最终浓度为12.5％）于-40℃、-80℃保存。在以后数天 内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。 据报道，无论是用辐射处理，还是用化学诱变剂处理 后的菌悬液或培养液，浸在冰浴中2-3h，试验的重复性很 好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一 措施来提高诱变效果。 NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿 工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。 凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，利用自来水大 量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。
诱变处理方法： ①用一定值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。② NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液， 其比例为缓冲液9ml：NTG丙酮溶液lml，浓度为NTG 1mg/ml； 使用时取母液0.2ml +菌悬液1.8ml，NTG终浓度为100ug/ ml。 一般随菌种不同而异，细菌一般为100-1000 ug/ ml，放线菌、 真菌为l000-3000 ug/ ml。③放线菌在生长适宜的温度下培 养，（细菌30-35℃、真菌25-28℃、放线菌30-32℃）处理若 干时间，一般细菌20-60min,孢子90-120 min④终止反应。冷 的生理盐水50倍稀释处理，或经过离心洗涤处理，作一定稀 释度分离于平皿。如果是细菌，把培养基按一定浓度加入到 菌体沉淀物中，振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，再涂平 皿。
（5）后培养 冰浴后的菌悬液加人到适合于正突变体增殖的培养基 中，在适宜温度下培养1.5～2h。有些在增殖培养基中加 人适量的酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质，可以抑制 修复，有利于突变体繁殖和减少细胞悬液在贮存过程中的 死亡。
四、电离辐射
1．常用于诱发突变： 快中子、X射线线和r射线等。
2．电离辐射剂量 拉德（rad）也可以转成伦琴（R）； 不同种类菌种最适的剂量范围不同；对不同的射线的敏感度 也不同；不宜反复照射。杀菌率90％-99.9％为宜 。 3．电离辐射的照射方法 菌悬液较好，不宜过多。照射后冰浴2-3h低温可降低或抑 制修复酶的活性。
五、近年的新型诱变剂
1．微波 2．红外射线 3．激光 4．高能电子流 5．离子注入
第二节 化学诱变剂
化学诱变剂是一类能对DNA起作用、改变其结 构、并能引起遗传变异的化学物质。
化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。 化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或 极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避 免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上 污染环境，造成公害。
三、脱氨剂
亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易 挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2 （一）亚硝酸的诱变机制 脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。 A→H，C→U，G→X。A：T→G：C和G：C→A：T。亚硝酸 的诱变也可以发坐回复突变。 亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用， DNA复制，从而导致奕变。
处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH浸泡处 理。 NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方 法诱变处理，摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加 人5-10 ug/ ml NTG．并加几滴吐温60或吐温80，使 成乳化状（注意吐温对该菌生长是否有影响）；在平 皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制 成平板，NTG浓度为10-50 ug/ ml。或将琼脂培养基 制成平板．然后将NTG和菌体混合涂抹平板，此时NTG 浓度为10-20 ug/ ml。
五、羟化剂【以羟胺为例】
羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体， 溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。 1.羟胺的诱变机制 当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧 啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0， 羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸 腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、 G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时 还能和细胞中其他物质作用产生过氧化物，也具有诱变 作用。