工业微生物育种诱变剂
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
第五章 工业微生物育种诱变剂讲解
三、非电离辐射——紫外线
紫外线是电磁波谱中波长从0.01~0.40微米辐射 的总称，不能引起人们的视觉。电磁谱中波长0.01~ 0.04微米辐射，既可见光紫端到X射线间的辐射。
绝对剂量单位：erg/mm2 相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀 菌率在90%~99.9%时，诱变效果较好。
移动式紫外灯
15W紫外灯
不同微生物所需杀菌时间
15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下 照射微生物，要使杀菌率达到90％～99.9％的效果：
芽孢菌约需10 min； 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1～3 min； 一般微生物营养体照射3～5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.5～2 min。
在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如 加入某些物质，提高突变频率。
（二）紫外线诱变
1. 紫外线的有效光谱
最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外 线。
30W紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，15W紫外 灯80%波长几种在2537Å，诱变效果比30W的好。
2. 紫外线的辐射剂量
第五章 工业微生物育种诱变剂
诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远 远超过自发突变率的物理因子或化学物质。
（1）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电 磁波等
（2）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、 调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、 化肥、化纤等。
（3）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄 生虫等。
第五章工业微生物育种诱变剂
亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
19
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ C→A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
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•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液
加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离
第七章工业微生物诱变育种
丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。 或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。
（三）环境条件的影响
1、诱变前预培养和诱变后培养
预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、
吖啶黄、b－重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。
后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是
立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是 让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟 现象。
五、快速准确的检测方法
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法 液相色谱法 气相色谱法
化学滴定法 薄层层析法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。
4、浓度梯度法
合成抗生素的水平与其耐自身产物能力相关。
5、应用复印技术快速筛选变株
产脂野生株、具有高脂含量的突变株。 方法：筛选培养基→ 复印→ 苏丹黑染色→洗去 多余染料→酒精脱色→干燥显色→选择深蓝色或紫 色的菌落。
6、琼脂块大通量筛选变株
适用对象：抗生素、酶类产物。 优点：效率提高15-20倍。 缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。
某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
菌丝尖端法
枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋 白胨配成3-4×105个/mL浓度共50ml。
第四章 工业微生物育种诱变剂
（三）紫外线诱变的步骤与方法： （1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。 （2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏 等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质， 如咖啡碱或异烟肼等。 （3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107～108ml-1， 霉菌约106 ml-1。 （4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结 束时冰浴1-2h。
2．甲基磺酸乙酯（简称EMS） 甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一 种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于 水，不稳定，易水解成无活性物质。 EMS的诱变处理方法： ①EMS母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将 需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配 制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓 冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中 易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种 类不同有所差异。 3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与 每种微生物修复系统的强弱有关。
二、辐射引起生物效应的影响因素
1．微生物的遗传背景 ：G+C% 2．微生物的生理状态 3．可见光 4．细胞水分 5．温度 尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作 用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺 氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。
烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及 磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起 突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟 嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂 起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是 鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主 要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2， 腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占 烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起 的突变仅是少数。 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂， 而造成突变。
微生物育种复习资料
第一章绪论一、微生物遗传育种对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。
二、微生物遗传育种的具体目标:1、提高产量生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标2、提高产物的纯度，减少副产物如色素；提高有效组分3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌4、遗传性状特别是生产性状稳定5、改变生物合成途径，获得新产物三、优良发酵菌株应具备哪些特性1、遗传稳定2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体）4、种子生长旺盛5、发酵周期短，产量高，产物单一6、产物易于分离纯化第二章微生物遗传学基础一、名词解释：基因：遗传信息的基本单位。
一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。
转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。
转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重组接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。
菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
二、突变型的种类形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。
三、试质粒的性质及其在基因工程中的应用性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。
应用：基因工程中作为载体将目的基因带入宿主细胞；其所带抗性基因可作为标记基因；降解复杂有机化合物；合成限制性内切酶或修饰酶。
第三章遗传与变异一、基因组对于原核生物来说，就是它的整个染色体；对于二倍体的真核生物来说，是能够维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
关于微生物育种中化学诱变技术的综述
关于微生物育种中化学诱变技术的综述姓名：周旭班级;11生工1 学号：20110801120摘要：化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且近来还用于改造野生菌株代谢功能，以发现新产活性产物。
本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。
关键词：微生物育种；化学诱变剂；诱变机制；应用1前言菌种优劣对于微生物药物的工业化生产具有决定性意义。
野生菌株往往因产率低而不能直接用于工业生产，而需要通过菌种改良，选育高产优良菌株。
微生物药物的工业化生产对菌株的这种需求带动了各种育种技术的蓬勃发展，而育种技术则通过不断提供优良菌株又促进了微生物药物产业的持续发展。
在育种研究中，近来还发现有些突变株可代谢产生新产物，具有可供作药源新菌株资源的潜在应用前景，使育种技术进一步拓展了新的应用研究发展空间。
微生物人工诱变育种技术按诱导突变类型可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变三大类［1］。
化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且还用于改造野生菌株的代谢功能，从而发现新产活性产物。
在实际应用中，化学诱变既有利用某一种化学诱变剂的单一诱变，也有组合利用化学或其他多种诱变剂的复合诱变，还有化学诱变联合抗生素抗性筛选等。
本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。
2常用化学诱变剂2.1碱基类似物作为化学诱变剂的碱基类似物主要有嘧啶类似物和嘌呤类似物两大类。
其中，常用嘧啶类似物有5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-氮杂尿嘧啶（6-NU）等；嘌呤类似物有2-氨基嘌呤（2-AP）、6-巯基嘌呤（6-MP）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）等［2］。
2.2烷化剂烷化剂类化学诱变剂种类较多，如硫芥（氮芥）类、环氧衍生物类、乙撑亚胺类、硫酸（磺酸）酯类、重氮烷类、亚硝基类等。
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5.1 物理诱变剂 5. 2 化学诱变剂 5. 3 生物诱变剂
工业微生物育种诱变剂
诱变： 通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生 物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
➢ 1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
1.4 非电离辐射——紫外线
工业微生物育种诱变剂
136-390nm
1.4 非电离辐射——紫外线
紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备 简单、操作方便、价格低廉。
紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而 且不易发生回复突变。
因此紫外线是一种使用最早也是沿用最 久的应用效果最明显的物理诱变剂。
DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上 百倍。 紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联； ②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成 嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。
(2) 紫外线的辐射剂量 绝对剂量：单位用erg / mm2 (1 erg = 10 –7 J )，需要用一种剂量仪来 测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。 相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示 剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时 间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射 时间决定。 用紫外线的杀菌率表示时，一般认为90～99.9％效果较好。
0.006~1.4nm
非电离辐射 不产生离子
工业微生物育种诱变剂
紫外线
136~390nm
波长短于紫色 光的肉眼不可 见“光线”
1.2 物理诱变剂的生物学效应
1.辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是 由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂 的连锁反应过程，通常可分为物理、物理－化学、化学和生物学 四个阶段。
工业微生物育种诱变剂
1.4 非电离辐射——紫外线
–2. 紫外线诱变
(3) 紫外线照射的策略：最适剂量因微生物而异，紫外照射 剂量与杀菌率在一定范围内成正比。
① 使用15W紫外灯2支，安装于镀铬灯罩内，使2537 Å光波集中于 被处理的微生物细胞，可以提高变异率。
电离辐射：主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变。 非电离辐射：主要导致形成嘧啶二聚体。
与辐射剂量的关系
引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比 在相同的总辐射剂量的条件下，不论是一次连续照射还
是分次累加照射，也不论是高剂量短时间照射还是低剂 量长时间照射，其诱变效应基本上是相等的。
工业微生物育种诱变剂
1.3 辐射引起生物效应的因素
辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内在遗传因素，也受外界环境条件 的影响。 微生物因素:
1. 微生物的遗传背景: 不同菌种由于遗传性状各异，对辐射的敏感性亦各不 相同。如：A和T比例高，对紫外线越敏感，对电离辐射则相反。
2. 微生物的生理状态：微生物细胞壁结构、修复系统的强弱 环境因素:
2.分子结构变化:由辐射引起DNA分子结构变化中最常发生的是 DNA单链或双链断裂：
单链断裂：多于双链断裂，易被修复系统修复。 双链断裂：一部分也可以通过修复系统修复，但双链断裂易使染色体发
生畸变或者使微生物死亡。
工业微生物育种诱变剂
1.2 物理诱变剂的生物学效应
3. 生物学效应
与辐射类型的关系
1.2 物理诱变剂的生物学效应
4. 辐射作用机制
直接物理作用假说 间接化学作用
工业微生物育种诱变剂
切尔诺贝利核爆炸
工业微生物育种诱变剂
工业微生物育种诱变剂
工业微生物育种诱变剂
工业微生物育种诱变剂
2011年3月11日爆发的9.0级特大地震影响， 日本福岛核电站反应堆发生氢气爆炸
工业微生物育种诱变剂
工业微生物育种诱变剂
1.4 非电离辐射——紫外线
2. 紫外线诱变
(1) 紫外线的有效光谱 DNA吸收的紫外线光谱通常为260nm，因此能诱发微生物突变的紫 外线的有效波长范围是200～300nm，最有效的波长为 253.7nm(2537Å)。 一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范围广，诱变效率较 差；而15W紫外灯管产生的紫外线大约有80％波长集中在2537Å， 因此诱变效应比30W的好。
工业微生物育种诱变剂
1.1 物理诱变剂的种类
物理诱变剂包括：紫外线，X射线，γ射线，快中子，α射线，β 射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。
辐射 指的是能量以电磁波或粒子（如阿尔法粒子、贝塔粒子等）
的形式向外扩散。
X射线
电离辐射
0.06~136nm
高能电磁波
产生正离子
γ 射线
物理辐射
➢ 在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性 状变异，其效应与X射线相类似。
➢ 陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作 用。
➢ 近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突 变的重要技术——基因诱变在菌种选育中得以应用， 使生 物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。
1. 可见光：能激活光复活酶的活性，分解紫外线引起的嘧啶二聚体 2. 水分：含水量影响细胞对辐射的敏感性，如：含水酵母比干酵母敏感 3. 温度：较高的温度能促进氧气与自由基之间的作用,使射线与DNA接触过
程所引起的化学反应加速 4. 空气或氧气：有氧比缺氧时的电离辐射效应更好
工业微生物育种诱变剂
工业微生物育种诱变剂
诱变剂的概念与种类
什么是诱变剂？有哪些分类？ 诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率 远远超过自发突变率的物理因子或化学物质
物理诱变剂
诱变剂种类
化学诱变剂
工业微生物育种诱变剂
生物诱变剂
第一节 物理诱变剂
1.物理诱变剂种类 2.物理诱变剂的生物学效应 3.辐射引起生物效应的因素 4.非电离辐射——紫外线 5.电离辐射 6.近年来发展的新型诱变剂
工业微生物育种诱变剂
1.4 非电离辐射——紫外线
1. 紫外线的诱变机制 和DNA损伤修复
单链上的二聚体会影响到复 制时的碱基正常配对。
双链上的二聚体会阻碍双链 的分开，复制到这一点就无法 继续进行，造成DNA链的异常。 紫外线的诱变机制
形成嘧啶二聚体 DNA损伤修复
光修复, 切补修复（暗修复）