密度梯度离心法-抽提脑突触体

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5．浓度便于测定，如具有折光率。
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R-z离心法梯度介质
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①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、 糖原 ②无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、 NaCl、KBr等 ③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide） 等 ④硅溶胶：如Percoll ⑤蛋白质：如牛血清白蛋白 ⑥重水D2O ⑦非水溶性有机物：如氟代碳等
脑突触体分离
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组织按1：10（1g:10ml）的比例投入冰冷的PH 7.4匀 浆缓冲液，用匀浆器制备匀浆后移至离心管。 离心 1,000g x 10 min，将上清液S1移至干净试管。 离心 16,000g x 20 min，留取沉淀P2。 将沉淀溶于10倍体积的0.32 mol / L 蔗糖液。 铺于蔗糖梯度上（0.8 mol / L【27%】和1.2 mol / L 【41%】各1.5ml）离心65,000g x 45min。收集 0.8mol/L与1.2mol/L蔗糖界面之间的致密物。 用PBS溶液（pH7.4）洗去蔗糖，再离心16,000g x 30min，收集沉淀即为突触体。
常用于等密度离心梯度材料
等密度梯度离心
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①离心时间要长 ②可用角式转头或水平式转头
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③粒子密度相近或相等时不宜用
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④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度
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⑤不能用刹车
密度梯度离心
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优点：
①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有 一定浮力密度差的颗粒； ③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带 由于对流而引起混合。
密度梯度离心
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速率-区带 (R-z)离心法
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等密度沉降
V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r
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V：是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒） d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形 颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。 σ：样品颗粒的密度（克/厘米3） s：密度梯度液的密度（克/厘米3） η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米· 秒） ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分 r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米） 当σ>S时 V>0即样品顺离心力方向沉降 σ〈 S时 V〈 0即样品逆离心力方向上浮 σ=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，"稳定"在这一位置 用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降 （或上浮）行为。
凹凸梯度
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为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于 沉入梯度，我们常常将梯度曲线在近梯度面处 有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的 密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸 指数曲线梯度，与此相反，如果液面处梯度液 足以支持（托住）样品，故考虑到某些样品在 离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区） 才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型 梯度便能满足这个要求。
梯度形状的选择
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梯度形状：是指梯度介质没着离心管长轴方向的密度变化特征。 R-z离心： 连续梯度：直线型的（等速梯度） 光滑曲线型（凸指数、凹指数、凹凸指数） 等密度离心： 连续梯度 自成梯度 不连续梯度：阶梯形 预成梯度
差速离心法
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优点：
操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使 用容量较大的角式转子。
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缺点：
①分离效果差，不能一次得到纯颗粒； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一 侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚 集而失活。
沉降系数
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颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速率。 用小写斜体s表示。 等于每单位离心场的速度。或s=v/ω2r。s是沉 降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r 是到旋转中心的距离，v是沉降速度。 1S=10-13秒 Eg：核糖体及其亚基在30S和80S之间
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离心机使用过程中的壁效应
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壁效应是正常的离心机离心管中由于细胞沉降方向与 管壁不平行引起的，即使在甩开转子中也会导致细胞 在离心管壁处聚集，当介质选择不当时，细胞与管壁 接触就被吸附，增加了产生凝块的可能性，也会丢失 沉降到离心管壁的细胞。 在离心机固定角转子中用等密度法分离时，有时会产 生严重的壁效应，在离心淘洗过程中，细胞同样会黏 附到锥形腔上，黏附作用有时很强，如用牛血清蛋白 作淘洗介质时，黏附到壁上的细胞不能用缓冲液冲掉。
亚细胞结构分离技术密度梯度离心法
离心技术
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差速离心 differential centrifugation
是指在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不 同大小的细胞和细胞器。
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密度梯度离心 density gradient centrifugation
是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度， 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的 作用使细胞分层、分离。
0.32M蔗糖 匀浆1ml 0.8M蔗糖 1.5ml 1.2M蔗糖 1.5ml
Thank you
等速梯度
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在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以 恒定速度沉降。 在做到等速沉降，必须使梯度和粘性力的增加 与沿着离心半径方向的离心力增加相平衡，在 这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间， 离必力，以及颗粒本身的沉降多数成正比。因 此如果已知某单一组份样品的沉降分数，就可 以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系 数。
How to make sucrose density gradients
Beckman polyallomer tube
线性梯度制备系统SJK2
NATURE PROTOCOLS
2ml x 4
F3：0.55um
F4：0.64um
差速离心法
速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀
(a)细胞匀浆；(b)细胞碎片；(c)线粒体、过氧化物酶体、溶酶体； (d)微粒体、核糖体；(e)细胞液；(可溶性蛋白质及小分子生物)
离心力场
离心过程
离心时间
较短，一般为几小时到几小时
密度梯度材料的选择原则
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1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。 2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低， 离子强度和pH变化较小。
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3．不会对离心设备发生腐蚀作用。
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4．容易纯化，价格便宜或容易回收。
离心机的转子
（a）水平转子；（b）固定转角转子；（c）垂直离心管转子
试剂配方
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匀浆缓冲液 0.32 mol / L 蔗糖，1 mmol / L EDTA， 10 mmol / L HEPES-NaOH， PH 7.4。 0.8 mol / L 蔗糖液 0.8 mol / L 蔗糖，1 mmol /L EDTA， 10 mmol / L Tris Hcl， PH 7.5。 1.2 mol / L 蔗糖液 1.2 mol / L 蔗糖，1 mmol /L EDTA， 10 mmol / L Tris Hcl， PH 7.5。 Buffer A 1% Triton X-100， 20 mM HEPES， 100 mM Nacl， 2 mM EDTA， 5 mM NaF， 1 mM Na3VO4， 1 mM aprotinin， 1 mM leupeptin， 1 mM PMSF， PH 7.2 。 Buffer B 15 mM HEPES，0.15 mM NaCl，1% SDS，10 mM EDTA，1 mM DTT，5 mM NaF， 1 mM Na3VO4，1 mM aprotinin， 1 mM leupeptin， 1 m M PMSF， PH 7.5 。
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密度梯度离心
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速率-区带 (R-z)离心法
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等密度沉降
R-z离心法中梯度液的作用
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离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支 持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而 引起已分层的粒子再混合。（减少样品的扩 散）
密度梯度离心法
R-z离心法 分离原理 介质 以物质沉降速度的不同进行分离 等密度沉降法 以物质的浮力密度不同进行 分离 密度小， 密度大， 如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖浓 如CsCl, 密度为1～1.9g/cm3， 度10%~67%，密度1～1.3g/cm3， 自成连续梯度 预制梯度，不连续 强，离心速度高，使被分离物质 易沉降 样品向离心管底沉降 稍强，速度相对低，使CsCl 形成梯度，建立沉降扩散平 衡 不论样品起始时在什么位置， 离心中样品停留于介质的等 密度部位 较长，十几小时到数天
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缺点：
① 离心时间较长； ② 需要制备梯度； ③ 操作严格，不宜掌握。
蔗糖密度梯度离心 preparation of synaptosomes
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1. Preparation of sucrose gradients 2. Homogenization 3. Preparation of S1 fraction from brain tissue 4. Preparation of P2 fraction from brain tissue 5. Sucrose gradient fractionation procedure 6.Transfer of synaptosomes from sucrose to an isotonic solution 7. identification and analysis