大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)
质粒DNA的人工氯化艳线性梯度分离法
效果更佳。
在紫外灯下，抽提质粒带时要看清界面，
ｐＲ 的 ｏ 带， ｃ Ｂ ３２ ２ ｃ 在 ｃ ｃ带的上部， 小心地抽
图 ４ 由图 ３ 抽出的大质粒和染色体带与碱酚 抽提的质粒的凝胶电泳图的比较
讨
论
取就可分别获得纯的 ｏ ｃ和 ｃ ｃ ｃ质粒；染色体 Ｄ Ａ远离小质粒带， Ｎ 在小的质粒中不易混进染 色体 Ｄ Ａ 而大质粒带上部是染色体带，不 Ｎ 。 小心时，抽出的大质粒中易混进少量 染色体
样品一起电泳 ， 结果见图 ４ 粗制大质粒含有一 ，
ｓ
从 １ 的细菌培养物，得到 ｐＲ ２ ｃ １ Ｂ３ 的 ｃ ２ ｃ 质粒 ３０ｇ 得到 ｏ １０ ０ｐ ， ｃ ，；同样体积的细菌 ５ｐ ｇ
培养物可得大质粒４０ｇ ０１。对ｐＲ 作过转 ｚ Ｂ ３２ ２
化试验。与均一Ｃ Ｃ－ Ｂ离心得到的 ＤＮＡ的 ｓＩ Ｅ 转化率相似。
犯 幼 倡 状
歇 曰 牲 松
但 裹 窦 娜
大质校
配制线性梯度 （Ｃ － ｌ溶液取决于两种不同 ＂ ， 浓度的 Ｃｃ 溶液， ｓｌ 当低浓度的Ｃｃ 小于 ０ Ｍ ｓｌ ． ６ 时， 加人的Ｄ Ａ样品要减少； ６ ＣＣ 浓度 Ｎ 比 Ｍ ｓｌ 更高时， 又会缩短离心后呈现的染色体Ｄ Ａ和 Ｎ 质粒带 Ｄ Ａ带之间的距离， Ｎ 影响分离效果。 若 低于 ６ Ｍ时， ｐＲ ２ 的 ｃ 构形Ｄ Ａ 则 Ｂ ３２ ｃ ｃ Ｎ 更靠近 离心管底部。 象本文用的两种质粒选用 ０ Ｍ ． ６
个大质粒和一个小质粒，还有染色体片段。而
抽 出的大质粒带只有大质粒 Ｄ ＮＡ，染色 体 带 只有染色体片段。
稍上的带是上面提到的 ｏ ｃ质粒。
带 Ｋ ８ａ ８ ｃ抗原质粒经人工线性 ＣＣ－Ｂ ｓＩ Ｅ 离心后， 在紫外灯下呈现 ３条 Ｄ Ａ 带 （ Ｎ 见图 ３， ） 上带是染色体片段带， 稍下是大质粒带。 抽出染色体和大质粒带，再和粗制大质粒
质粒抽提原理
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
(CsCl 密度梯度离心法)
中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。
（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。
（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。
因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。
）3.室温离心5,000rpm，5min。
弃上清，控干。
4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。
（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。
否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。
）5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。
（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。
加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）6.加7mL P3。
（P2和P3之间反应时间不要超过5min。
混匀后可见絮状沉淀。
该步若置于冰上，沉淀效果更好。
但位于室温的反应以足以达到实验需要。
）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。
7.室温（4度更好，但没有必要。
）离心，10,000 rpm, 5min。
8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。
加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于4度。
若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。
（分子克隆p35）9.室温离心10,000rpm 15min。
10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。
11.3,000 rcf离心3min，弃上清。
（可以不要非常完全控干）12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。
病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化-zsd
病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化：1. 将293细胞铺于30-40个10cm dish，至细胞长满，每块板加入合适滴度的病毒（约107-108 pfu/ml）10 µl，感染细胞，待细胞全部病变后（4-7天），每块板中加入约500 µl（150ul）10% Nonidet P 40（NP40）以裂解细胞。
收集整个细胞裂解物，如果不是立即做CsCl纯化的话，可放在-80°C 冰箱。
2. 12,000 rpm离心10 min，弃细胞碎片，收集上清。
每100ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5M NaCl），冰上1 hr沉淀病毒。
3. 12,000 rpm离心上述混合物20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-Hcl，pH 8.0）。
4o C 7,000 rpm离心5 min，收集病毒悬浮液。
4. CsCl梯度的制备，用滴管轻轻加入2.0 ml的CsCl （密度1.40g/ml，溶剂同上）。
再加入3.0 ml 密度为1.30 g/ml 的CsCl 溶液。
再加入5 ml的病毒悬浮液。
20,000 rpm，室温离心2 hr。
收集密度在1.30-1.40g/ml 之间的病毒条带至透析袋中，透析袋用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min。
在透析缓冲液（将50g蔗糖，10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1,000 ml）中，4o C 透析过夜，中间换一次透析液。
收集病毒，测定病毒滴度。
三种密度的CsCl溶液配制（溶于灭菌20 mM Tris中, pH8.0），4℃保存。
欢迎下载，谢谢观看！资料仅供参考学习。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
DNA提取原理和方法
NaOH ：溶解细胞，DNA变性
SDS ： (1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 (2)解聚细胞中的核蛋白。 (3)SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS与NaOH联用：增强NaOH的强碱性
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用
DNA的保存 ：
1. DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。 2. 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度 成正比。
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
碱裂解法
密度梯度离心法
煮沸法
质粒DNA的提取--碱裂解法
1、培养细菌使质粒扩增 ---对数生长后期 2、收集和裂解细菌 3、质粒DNA的纯化
12. If there is no pellet, place samples in -80º C for 10 min
and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4º C; 13. Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; 14. Resuspend DNA in ddH2O.
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;
dnadna提取的几种方法提取的几种方法质粒dna的提取断裂成为线状共价闭合环状结构dna细胞破碎方法应用机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌酵母物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌病毒4低渗裂解红细胞化学法1有机溶剂细菌酵母2去垢剂组织培养细胞3酶解法细菌酵母根据裂解方式的不同有
质粒提取
４、加入３50 μl Solution Ⅲ，上下颠倒10次, 离心 12,000rpm 10min; ５.取上清（不可吸到絮状沉淀）臵于对应编号并带有 收集管的离心柱，离心10，000×g 1min，弃液（可 重复一次，提高DNA量，即集中管液倒回离心柱）； ６.加 500ul HB（深度清洗）离心10，000g 1min，弃 液（可重复一次）； 7.加Wash Buffer（确保已加入无水乙醇） 700ul 离心 10，000g 1min，弃液（可重复一次）； 8.空柱离心12，000g 2min； 9. 加Elution Buffer 50ul ,下接标记好的Ep管，盖上离心 柱的盖子 60℃温育10min,离心13，000g 2min
质粒大于15kb在细胞裂解操作时容易受损， 故应采用温和裂解法从细胞中释放出来。通常 将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，再用溶菌酶和 EDTA（乙二胺四乙酸）进行处理，破坏细胞 壁。然后加入SDS （十二烷基磺酸钠）等去污 剂裂解球形体。
小质粒(小于15KB)的处理可用较剧烈的方法
对小质粒的操作可以用许多无需特殊处理的裂 解方法。典型的方法是让细菌溶解物悬于去污 剂中，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理 能破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA变性。闭环质粒DNA链则处于拓扑缠绕状 态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA链迅速得到准确配臵，重新形成完全的天 然超螺旋分子。
通过不连续或者预先形成的氯化铯梯度离心， 可在离心管中获得含有不同浓度ＣｓＣｌ的溶 液分层，样品位于中层（三级梯度法）或者底 层（两级梯度法）。在随后的离心梯度形成过 程中，ＤＮＡ找到其等密度点，从而使离心时 间大大缩短。
因为不连续梯度法不能达到真正的平衡，使其 闭环质粒ＤＮＡ与染色体ＤＮＡ直接的分辨率 不如自身形成的梯度那么高。一般说来，与二 级梯度法相比，三级梯度法能在较短的时间内 给出更好的结果。
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
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大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）
李渊越
1.预约摇床、超速离心机。
2.配TB培养基（1L锥形瓶中装250 ml培养液），并灭菌。
质粒做好转化，并涂板。
、。
17.超离后，取样品，用5 ml注射器加上12#针头，抽取EB带，（离心完可见两条EB带，上面一条细浅
的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带）放入50ml管中。
18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB，直到溶液澄清无色。
19.加入等体积TE（一定要加。
若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。
20.加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA是透明的，容易随
上清一起倒掉）。
6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。
21.加入450 µl (~900ul)水，把50mL离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。
22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH
5.2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C或-20C 15-30min。
13,000 rpm 离心10min。
23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。
24.去上清，以1mL TE溶解完全，测定浓度。
lysozyme-EDTA-RNase溶液
溶菌酶0.4 g
0.5M EDTA (pH=8.0) 25mL
RNase A (100mg/mL) 120uL
H2O 25mL
25％蔗糖:
蔗糖25 g
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml
过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。
0.5 M EDTA（pH 8.0）:
EDTA·Na·2H2O 186.1
g
NaOH 约20 g
加800 ml纯水溶解完全后，调pH至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。
Triton-lysis:
10% Triton-100 5mL
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 15 mL
H2O 100mL
湿热灭菌，常温保存。
PEG8000：
PEG8000 150 g
5 M NaCl 150 ml
加纯水定容至500 ml，湿热灭菌，常温保存。
EB（2mg/ml）：
EB 20mg
加超纯水10ml，溶解，室温保存。