病毒纯化密度梯度离心法
密度梯度离心法名词解释
密度梯度离心法名词解释密度梯度离心法，简称DGGE，是分子生物学中常用的一种分析DNA序列变异、基因分型、菌群多样性等的方法。
这种方法以PCR扩增的DNA片段作为目标，通过DGGE电泳技术将不同样品的DNA条带分离，进而分析不同样品中的DNA变异、基因型或者菌群结构。
DGGE原理基于DNA的双链分子在电场作用下会断裂成单链，然后是交替出现的分子器极吸附和交错序列的碱基浸润作用，最终排序各种DNA片段。
DGGE和传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，是基于DNA 片段移动到含有梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳板表面或者介质中（如聚合物链等）的不同位置，从而实现不同样品中 DNA 片段的分离。
因为在含有不同梯度的聚丙烯酰胺凝胶中，DNA片段会在某种梯度电场下保留在特定区域，形成明显的DNA 条带，样品与样品之间差异不大的DNA 条带在聚丙烯酰胺凝胶板上合并形成了带状图。
这些线条被称为DNA条带，代表了DGGE样本中的每个扩增片段。
DGGE方法最大的优点在于它可以等比例、标准化地比较基因片段的有无、变异类型和程度等信息，而且对于那些较短的DNA 片段而言，它在分析能力方面要高于Sanger定序。
DGGE的应用逐渐从基因型分析扩大到生态学及其它应用，比如在菌群生态学、变异鉴定、致病菌及病毒检测、种群学研究以及气叶互作与林木营养学研究等领域有广泛的应用。
总之，DGGE的主要特点在于其高效性、快速性和准确性，成为分子生物学和生态学分析技术的重要手段之一，其在微生物层面的应用更是颇有潜力。
同时，由于其对于样本的提纯和扩增要求较高，还需在实验上精益求精。
DGGE方法的优点、实验步骤和要求、应用场景等方面，建议科研学者进行深入研究和探索，为其在不同社会和环境背景下的发展做出更多的贡献。
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
病毒的分离纯化
病毒的分离纯化
我设计了一套方案，请大家批评指正：
1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。
组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。
2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟
3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。
冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。
4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。
5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。
冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。
6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH
7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。
7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。
8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。
lf_12345。
密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别
密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别密度梯度离心和密度梯度超速离心是两种常见的离心分离技术，它们在分离样品时有着不同的原理和应用。
本文将从原理、应用和优缺点三个方面来介绍这两种离心分离技术的区别。
一、原理
密度梯度离心是利用不同密度的物质在离心过程中分层的原理，将样品加入到密度梯度离心管中，离心后样品会在不同密度的梯度中分层，从而实现分离。
密度梯度离心的分离效果取决于样品的密度和离心管中的密度梯度。
密度梯度超速离心则是利用样品在离心过程中受到离心力的作用，从而分离出不同密度的物质。
在离心过程中，样品会受到离心力的作用，从而分离出不同密度的物质。
密度梯度超速离心的分离效果取决于样品的密度和离心力的大小。
二、应用
密度梯度离心主要应用于分离细胞、蛋白质、核酸等生物大分子，以及分离纯化病毒、蛋白质复合物等。
密度梯度离心可以分离出不同密度的物质，从而实现对样品的分离纯化。
密度梯度超速离心主要应用于分离细胞器、蛋白质、核酸等生物大分子，以及分离纯化病毒、蛋白质复合物等。
密度梯度超速离心可
以分离出不同密度的物质，从而实现对样品的分离纯化。
三、优缺点
密度梯度离心的优点是可以分离出不同密度的物质，从而实现对样品的分离纯化。
缺点是需要制备密度梯度离心管，操作比较繁琐。
密度梯度超速离心的优点是操作简单，不需要制备密度梯度离心管。
缺点是分离效果受离心力的大小和样品的密度影响较大。
密度梯度离心和密度梯度超速离心在原理、应用和优缺点等方面都有所不同。
在选择离心分离技术时，需要根据样品的特性和实验要求来选择合适的离心分离技术。
病毒的超速离心纯化
病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。
实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。
蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。
30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。
1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。
具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。
向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。
此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。
24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。
2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。
3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。
离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。
密度梯度离心法的原理解析
密度梯度离心法的原理解析密度梯度离心法是一种广泛应用于生物化学、分子生物学和医学领域的实验技术，用于分离和纯化生物大分子、细胞和次细胞结构。
该方法基于样品中不同组分的密度差异，利用离心力和密度梯度分离的原理来实现。
密度梯度离心法的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 密度梯度制备：制备一个由多个密度层构成的梯度液体。
这些密度层是根据密度逐渐增加或减少排列的，通常由离心管或离心管中的夹层形成。
常用的密度梯度制备物质包括蔗糖、葡萄糖或碘化物等。
2. 样品处理：将待分离的样品加入到密度梯度中。
样品可以是生物大分子如蛋白质、核酸或多肽，也可以是细胞或次细胞结构如细胞核或线粒体等。
3. 离心分离：通过高速离心设备，施加离心力将密度梯度中的样品分离。
离心过程中，样品中的各个组分受到的离心力不同，根据其密度的差异在密度梯度中上下移动。
离心力越大，移动距离越远。
4. 提取和分析：离心分离后，不同密度层中的组分被提取出来，然后进一步进行分析。
这可以是采用分光光度法、蛋白质电泳、质谱分析或核酸杂交等技术。
通过分析不同密度层中的组分，可以获取样品中各种生物大分子或细胞结构的纯度和数量信息。
密度梯度离心法的优点是可以实现高分辨率和高效率的分离和纯化。
这是因为，不同密度的组分在离心力的作用下可以根据其密度差异均匀地分布在梯度液体中，从而实现准确分离。
该方法对样品体积和细胞大小没有特别严格的要求，适用于分离和研究多种不同类型的生物样品。
密度梯度离心法还可以用于研究细胞功能和结构的多个方面。
它可以用于分离不同亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基体等，进一步研究它们的功能和组成。
该方法还可用于分离和纯化蛋白质复合物、染色体和病毒等，为进一步研究它们的生理和生化特性提供有力的工具。
总结和回顾上述内容，密度梯度离心法是一种基于样品中不同组分密度差异的分离和纯化技术。
它可以通过制备密度梯度、施加离心力和分析不同密度层中的组分来实现。
该方法具有高分辨率、高效率和广泛适用性的优点，可用于研究多种生物样品的分离和纯化，以及细胞和亚细胞结构的功能和组成研究。
病毒的浓缩和纯化
病毒的浓缩和纯化
收集发病鹅的脾脏、肝脏和肾脏，均浆用1:5稀释(Wt/vol)buffer A (10 Mm Tris-HCl ,100mM EDTA PH=7.2)离心10000 转，30分钟。
再加上双抗（10000LU/ML）青霉素和链霉素(1mg/ml)。
病毒浓缩的方法用的是蔗糖梯度离心方法。
首先，10000转离心30分钟，收集上清液，用三氯三氟代乙烷纯化两次为了除去脂层。
蔗糖溶液用在下一步的操作中，提前准备buffer A。
上清放于30％的蔗糖的溶液中超速离心。
上清重新用buffer A悬浮，放于25％－60％的不间断的蔗糖溶液中，超速离心120000转，16小时。
离心完后，收集密度差别的液体。
测定病毒的浮力的密度。
最后，分离的液体带再用1：3 buffer A稀释，离心2小时，120000转。
病毒小颗粒用悬200微升水。
密度梯度离心法和差速离心法
密度梯度离心法和差速离心法密度梯度离心法和差速离心法，这俩听上去有点复杂的名词，其实就像两位科学界的“明星”，在实验室里忙着干活，分工明确，各有千秋。
咱们得明白这俩法子的基本思路。
密度梯度离心法，顾名思义，就是通过不同物质的密度差异，把它们分开。
想象一下，就像一层层蛋糕，轻的浮在上面，重的沉到底，哇，那场景可美了。
就拿细胞里的成分来说，蛋白质、核酸等等，它们个个都想“游泳”，可游泳的能力可不一样，离心一转，轻的飘起来，重的往下沉，真是个生动的“分家”现场。
再说差速离心法，这个就更像一场赛车比赛了。
不同的颗粒速度不同，轻的跑得慢，重的飞得快。
就像你和朋友们比赛跑步，个头小的跑得慢，个头大的早就冲过终点了。
通过调节转速，分开各种细胞组分。
想象一下，实验室里一堆小试管，随着转速的提升，大家各自的“实力”被体现出来，最终你能看见那层层分开的美妙景象。
别小看这些，实验结果的好坏，直接关系到科学研究的成败呢。
这两种方法各有利弊，密度梯度离心法虽然能分得很细，但所需的时间、材料都不少，有时候还得看运气，谁让某些分子就是那么“娇贵”呢。
差速离心法简单、快速，但它的分离效果有时候也不能做到非常精准。
说到底，就像做菜，有的人喜欢慢工出细活，有的人偏爱火速出餐。
选哪种方法，完全看研究者的需求和手里的资源。
说到实际应用，密度梯度离心法常常用在那些需要高纯度的生物样本提取中，比如说分离病毒、细胞器之类的。
科学家们就像是做魔术，把复杂的生物成分变得井井有条。
试想一下，实验室里一片忙碌，试管里的液体五光十色，细胞器们像小精灵似的浮动，真是奇妙无比。
而差速离心法则多用于常规分离，效率高，速度快，适合那些不太“挑剔”的样本。
就好比快餐店，顾客多，必须得迅速上菜，满足大家的需求。
咱们在日常生活中其实也常常用到类似的原理。
比如，洗衣机转的时候，水和衣物的密度差异让衣物中的水分快速被甩干，这和离心法有异曲同工之妙。
再比如，水果沙拉，咱们也会把不同的水果按喜好放在一起，轻的放上面，重的放下面，吃的时候层次分明，这不就像科学家们在实验室里的精心布局嘛。
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病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。
病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。
物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。
病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。
免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。
结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒纯化方法:
1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。
但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。
2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。
Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。
密度梯度离心法
英文名称： density gradient centrifugation method
〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现
一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内
比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就
会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别
进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊（M．Meselson），
斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分
离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。
为得到
必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯
浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通
常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为
目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好
的蔗糖等的密度梯度。
〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在
分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层
少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。
若含有
沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。
这种情况采用适当
的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。
这是与〔1〕
不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速
度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。
因多采用蔗糖密
度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。
按同样原理，也可使
用分析超离心机进行测定。
工作原理
又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；
原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用的有蔗糖、甘油；
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
主要应用
可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。
操作
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。
其过程如下：
1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。
11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。
5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。
-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。
注意事项
离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。
离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。
再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中的颗粒分开收集，得到所需的物质。
1、梯度介质应具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围。
2、梯度介质不会与样品中的组分发生反应。
3、梯度介质也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。
4、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽。
为此，应适当增大离心力、缩短离心时间，可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。
STE缓冲液（Sodium-Tris-EDTA，STE）
•10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)
•0.1 mol/L NaCl
• 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)
在15 psi (1.05 kg/cm2)高压下蒸汽灭菌 15 min。
将灭菌溶液与 4°C保存。
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，病毒粒子呈球型，直径为55～60纳米，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。
基因组为单分子线状正链单股RNA，大小为13 000-15 000nt，具有5，端帽及3，端聚A尾。
该病毒在一种动物传代细胞（恒河猴胚胎肾上皮细胞Marc-145）上培养后，反复冻融细胞使病毒从细胞中释放出来后，通过超速离心纯化病毒。
我们可以提供纯化的病毒液和提取的病毒总RNA。