密度梯度离心法取单个核细胞具体方法 ppt课件
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密度梯度离心法PPT课件
即： 1S= 10-13秒 例：某物质的沉降系数是10-12秒
可写成：10× 10-13秒 表示为：10S
如：核蛋白体为 70S
细胞及细胞内某些成分的沉降系数及其离心条件
名称 沉降系数/S
RCF/g
转速（rpm）
细胞
﹥107
﹤200
﹤1500
细胞核 4×106-7
600~800
3000
线粒体 2×104~ 7×104
三、沉降系数（sedimentation coefficient，S） 1924年Svedberg对沉降系数下的定义：
颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
若ω用2πn/60表示，则
式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离； X2为离心后粒子离旋转轴的距离。
S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13 秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒。
1994 Avanti J全球独有,利用可变磁阻驱动系统的高效离心。 1996 Optima XL-I拥有两种检测系统的分析型超速离心机。 1998 Optima MAX全球首台超过一百万离心力的台式超速
离心。 1998 ARIES全球独有可以自我修正平衡的转头。 2002 Optiam L-XP全球首先采用触幕式操作的超速离心机。 2004 Allegra X-12全球唯一可处理细胞培台式离心机。
1979 L8 Series全球首先采用微机控制及感应电机驱动的 超速离心机系列。
1982 J21-M全球首台采用感应电机驱动的高速离心机。 1984 TL-100全球首台微量台式超速离心机。 1989 Optima Series 首先采用半导体制冷的驱动系统的超
速离心机系列。
1989 NVT创新的近垂直转头,可快速提纯DNA样品。 1991 Optima XL-A重新设计的分析型超速离心机。
可写成：10× 10-13秒 表示为：10S
如：核蛋白体为 70S
细胞及细胞内某些成分的沉降系数及其离心条件
名称 沉降系数/S
RCF/g
转速（rpm）
细胞
﹥107
﹤200
﹤1500
细胞核 4×106-7
600~800
3000
线粒体 2×104~ 7×104
三、沉降系数（sedimentation coefficient，S） 1924年Svedberg对沉降系数下的定义：
颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
若ω用2πn/60表示，则
式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离； X2为离心后粒子离旋转轴的距离。
S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13 秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒。
1994 Avanti J全球独有,利用可变磁阻驱动系统的高效离心。 1996 Optima XL-I拥有两种检测系统的分析型超速离心机。 1998 Optima MAX全球首台超过一百万离心力的台式超速
离心。 1998 ARIES全球独有可以自我修正平衡的转头。 2002 Optiam L-XP全球首先采用触幕式操作的超速离心机。 2004 Allegra X-12全球唯一可处理细胞培台式离心机。
1979 L8 Series全球首先采用微机控制及感应电机驱动的 超速离心机系列。
1982 J21-M全球首台采用感应电机驱动的高速离心机。 1984 TL-100全球首台微量台式超速离心机。 1989 Optima Series 首先采用半导体制冷的驱动系统的超
速离心机系列。
1989 NVT创新的近垂直转头,可快速提纯DNA样品。 1991 Optima XL-A重新设计的分析型超速离心机。
离心原理PPT课件
一、步骤
1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混 匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主 要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、 中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带 ，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有 血小板。
Ø 分离、纯化样品; Ø 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
.
2
一、离心的一般原理
颗 颗粒的密度、形状、大小
粒
运 液体介质的密度、粘度和重力场
动
的 的强度
方
向 悬浮颗粒在液体介质的扩散运动
和
速
颗粒越小，则沉降越慢，
度
扩散. 现象越严重。
3
1、离心力和相对离心力
离心力(centrifugal force，F)
.
9
离心机的构造
†转头 †驱动装置 †速度控制系统 †冷却装置 †真空装置 †光学检测系统
preparative
ultracentrifuge
.
10
离 心 转 头
a 水平转头
b 角式转头 c 垂直转头
角度在14-40℃ 之间
.
11
实验中常用的是普通离心机（转速一般 不高于4000rpm），用于分离血清和 沉淀细胞、大的沉淀物等。
等特性的影响。
†预计沉降时间；
†测定物质相对分. 子质量。
6
3、沉降速度（sedimentation velocity, v）
沉降速度是指在离心力作用下，单位 时间内颗粒沉降的距离。
1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混 匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主 要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、 中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带 ，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有 血小板。
Ø 分离、纯化样品; Ø 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
.
2
一、离心的一般原理
颗 颗粒的密度、形状、大小
粒
运 液体介质的密度、粘度和重力场
动
的 的强度
方
向 悬浮颗粒在液体介质的扩散运动
和
速
颗粒越小，则沉降越慢，
度
扩散. 现象越严重。
3
1、离心力和相对离心力
离心力(centrifugal force，F)
.
9
离心机的构造
†转头 †驱动装置 †速度控制系统 †冷却装置 †真空装置 †光学检测系统
preparative
ultracentrifuge
.
10
离 心 转 头
a 水平转头
b 角式转头 c 垂直转头
角度在14-40℃ 之间
.
11
实验中常用的是普通离心机（转速一般 不高于4000rpm），用于分离血清和 沉淀细胞、大的沉淀物等。
等特性的影响。
†预计沉降时间；
†测定物质相对分. 子质量。
6
3、沉降速度（sedimentation velocity, v）
沉降速度是指在离心力作用下，单位 时间内颗粒沉降的距离。
密度梯度离心法取单个核细胞具体方法 ppt课件
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
9
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
10
方法
密度梯度离心法取单个核细胞具体
11
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
密度梯度离心法取单个核细胞
密度梯度离心法取单个核细胞具体
1
方法
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
密度梯度离心法取单个核细胞具体
14
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
密度梯度离心法取单个核细胞具体
9
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
10
方法
密度梯度离心法取单个核细胞具体
11
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
密度梯度离心法取单个核细胞
密度梯度离心法取单个核细胞具体
1
方法
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
密度梯度离心法取单个核细胞具体
14
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
密度梯度离心法取单个核细胞具体方法共29页文档
谢！
密度梯度离心法取单个核细胞具体方 法
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
密度梯度离心课件
样品装载
将准备好的样品装入离心管中 ，注意样品装填均匀，避免出
现空洞或偏心。
平衡液加盖
将平衡液加盖到离心管中，注 意液面高度与样品一致，以保 证离心效果和实验结果的准确 性。
离心条件设置
根据样品特性和实验目的，设 置合适的离心速度、时间和温 度等条件。
离心操作
启动离心机，按照设定的条件 进行离心操作。
平衡液不稳定
原因
平衡液不稳定可能是由于平衡液的成分不正确或离心过程中的温度变化引起的。如果平衡液的成分不正确，会导 致样品在离心过程中出现沉淀或聚集。而温度变化则会影响平衡液的密度，进而影响样品的分离效果。
解决方案
在选择平衡液时，应确保其成分与样品相似，并且具有稳定的密度。此外，在离心过程中应保持稳定的温度条件 ，以确保平衡液的密度不会发生变化。
原理
密度梯度离心原理基于样品中各组分的质量和离心力场中的浮力之间的关系。在 离心力场中，样品中的各组分会根据其质量和浮力差异进行迁移，质量较大的组 分会向离心管底部迁移，质量较小的组分会向离心管顶部迁移。
密度梯度离心的应用
01
02
03
分离细胞器
密度梯度离心可用于分离 细胞中的各种细胞器，如 线粒体、叶绿体、溶酶体 等。
清洗去除杂质，提高样品纯度和离心 效果。
平衡液配制
选择合适的平衡液
根据样品特性和实验目的 ，选择合适的平衡液，以 保证离心效果和实验结果 的准确性。
平衡液配置
按照平衡液配方和比例， 准确配置所需浓度的平衡 液。
平衡液过滤
过滤去除平衡液中的杂质 和颗粒物，确保离心效果 和实验结果的准确性。
离心操作
在离心过程中不得随意打开离心腔盖 子，以免气流冲击导致安全事故。
将准备好的样品装入离心管中 ，注意样品装填均匀，避免出
现空洞或偏心。
平衡液加盖
将平衡液加盖到离心管中，注 意液面高度与样品一致，以保 证离心效果和实验结果的准确 性。
离心条件设置
根据样品特性和实验目的，设 置合适的离心速度、时间和温 度等条件。
离心操作
启动离心机，按照设定的条件 进行离心操作。
平衡液不稳定
原因
平衡液不稳定可能是由于平衡液的成分不正确或离心过程中的温度变化引起的。如果平衡液的成分不正确，会导 致样品在离心过程中出现沉淀或聚集。而温度变化则会影响平衡液的密度，进而影响样品的分离效果。
解决方案
在选择平衡液时，应确保其成分与样品相似，并且具有稳定的密度。此外，在离心过程中应保持稳定的温度条件 ，以确保平衡液的密度不会发生变化。
原理
密度梯度离心原理基于样品中各组分的质量和离心力场中的浮力之间的关系。在 离心力场中，样品中的各组分会根据其质量和浮力差异进行迁移，质量较大的组 分会向离心管底部迁移，质量较小的组分会向离心管顶部迁移。
密度梯度离心的应用
01
02
03
分离细胞器
密度梯度离心可用于分离 细胞中的各种细胞器，如 线粒体、叶绿体、溶酶体 等。
清洗去除杂质，提高样品纯度和离心 效果。
平衡液配制
选择合适的平衡液
根据样品特性和实验目的 ，选择合适的平衡液，以 保证离心效果和实验结果 的准确性。
平衡液配置
按照平衡液配方和比例， 准确配置所需浓度的平衡 液。
平衡液过滤
过滤去除平衡液中的杂质 和颗粒物，确保离心效果 和实验结果的准确性。
离心操作
在离心过程中不得随意打开离心腔盖 子，以免气流冲击导致安全事故。
细胞器的分离、纯化实验ppt课件
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实验方法
玉米黄化幼苗线粒体的分别〔整个过程坚持在0-4℃ 〕
1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中 放置1小时
2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(分量体积比g:ml) 比例参与离心匀浆介质，快速研磨，留意先参与少 许介质液，研碎后将余液参与
3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃
该法的优点是：①分别效果好，可一次获得较纯颗 粒；②顺应范围广，既能分别具有沉淀系数差的颗 粒，又能分别有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会 积压变形，能坚持颗粒活性，并防止已构成的区带 由于对流而引起混合。
缺陷：① 离心时间较长；②需求制备梯度；③操 作严厉，不宜掌握。
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半径
方法： 两点一 线法
4. 试剂：
5.
① 线粒体离心匀浆介质。
6.
② 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。
7.
③ 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0
8.
④ 0.35mol/L NaCl
匀浆介质，普通为一定浓度的蔗糖溶液参与其它
9离. 子成分，可以维持亚细胞组分的浸透压。
Back
概述
离心机
！
制备性
分析性
普通离心机
细胞器的分别、纯化 — 细胞分级分别法
—秦川
实验目的
实验原理
实验用品
实验方法
运用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分别 2.蛋白梯度分别 3.脂蛋白分别 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯
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实验目的
• 认识离心机及学习离心机的运用方法 • 学习细胞器的分别及纯化的普通原理和
方法
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实验方法
玉米黄化幼苗线粒体的分别〔整个过程坚持在0-4℃ 〕
1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中 放置1小时
2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(分量体积比g:ml) 比例参与离心匀浆介质，快速研磨，留意先参与少 许介质液，研碎后将余液参与
3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃
该法的优点是：①分别效果好，可一次获得较纯颗 粒；②顺应范围广，既能分别具有沉淀系数差的颗 粒，又能分别有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会 积压变形，能坚持颗粒活性，并防止已构成的区带 由于对流而引起混合。
缺陷：① 离心时间较长；②需求制备梯度；③操 作严厉，不宜掌握。
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半径
方法： 两点一 线法
4. 试剂：
5.
① 线粒体离心匀浆介质。
6.
② 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。
7.
③ 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0
8.
④ 0.35mol/L NaCl
匀浆介质，普通为一定浓度的蔗糖溶液参与其它
9离. 子成分，可以维持亚细胞组分的浸透压。
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概述
离心机
！
制备性
分析性
普通离心机
细胞器的分别、纯化 — 细胞分级分别法
—秦川
实验目的
实验原理
实验用品
实验方法
运用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分别 2.蛋白梯度分别 3.脂蛋白分别 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯
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实验目的
• 认识离心机及学习离心机的运用方法 • 学习细胞器的分别及纯化的普通原理和
方法
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ficoll密度梯度离心
ficoll密度梯度离心ficoll密度梯度离心是一种分离组织细胞如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等的方法。
它是一种非物理性分离方法，基于不同细胞密度不同的原理进行分层分离。
该方法分离单个细胞时选择性很高，可以得到高质量的单个细胞，是细胞分离和富集的重要手段之一。
下面就具体介绍一下ficoll密度梯度离心步骤：1. 工具和试剂：ficoll、PBS缓冲液、离心管、离心机、无菌操作的平板和操作台、活细胞计数器和消毒液。
2. 细胞样品处理：制备细胞的离心液，将组织细胞含淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的全血或组织液用PBS缓冲液稀释10倍，轻轻混合，放入无菌操作的平板中。
3. ficoll密度梯度液制备：将密度逐渐递增的ficoll液体制成梯度液，方法为：向离心管中加入2ml浓度为1.077g/ml的ficoll液，然后缓慢地滴加2ml PBS缓冲液，使其密度降低为1.074g/ml，缓慢但均匀地加入2ml浓度为1.071g/ml的ficoll液，同样的方法，逐步制成梯度液。
4. 梯度离心分离：将制备好的离心液缓慢加入离心管中，完全覆盖上层的 ficoll 密度梯度液，离心3000rpm, 20min（具体离心速度和离心时间会因细胞类型和样品情况而有所不同，需根据实验需要调整）。
5. 收集样品细胞：从离心管底部用移液管吸取相对富含细胞的区域（未与 ficoll 接触的细胞，位于 ficoll 密度梯度液的底部），将其转入新离心管中，加 PBS 缓冲液洗涤细胞2~3次，沉淀每次5min，离心1800 rpm/5min。
6. 活细胞计数：溶解细胞样品，并在活细胞计数器中用ADM-1（0.4% Trypan blue）计数活细胞数量。
总结来说，ficoll密度梯度离心法是一种可靠而高效的细胞分离方法，其过程简单，操作容易掌握。
在细胞学研究中，该方法的应用十分广泛，被广泛应用于分离和富集单种细胞类型，包括未分离、单核、淋巴细胞组，分离的细胞可用于后续的蛋白质、RNA/DNA等分子水平的研究。
4.PBMC分离
Ficoll密度梯度离心法 外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMC)
外周血单个核细胞(PBMC)
包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫学实验最常用的细胞，也是T、B细胞分
离纯化的第一步。
常用分离方法：聚蔗糖-泛影葡胺(FicollUrografin)密度梯度离心法
1
2
2
1
1
2000rpm 20min
1
1000rpm 3 3 3 10min
3
方 法
稀释的抗凝静脉血1ml 取一只玻璃试管，加入1ml淋巴细胞分离液；转移血标 本于淋巴细胞分离液上层（注意：保持液面完整) 离心，2000rpm，20min 吸取单个核细胞（中间白膜层），转移至一新试管中
加入5倍量D-Hank’s ，混匀，离心，1000rpm，10min
弃上清，留少许重悬沉淀 滴一滴细胞悬液于载玻片上，盖盖玻片，镜下观察
结 果
(一)
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
(二) 镜下观察结果
实验报告
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
方法、原理、步骤、结果
原 理
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 比重为1.077±0.001
红细胞、粒细胞比重1.09；
淋巴细胞和单核细胞的比重1.075
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
凝兔子外周血 淋巴细胞分离液 D-Hank’s液 试管、吸管等
外周血单个核细胞(PBMC)
包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫学实验最常用的细胞，也是T、B细胞分
离纯化的第一步。
常用分离方法：聚蔗糖-泛影葡胺(FicollUrografin)密度梯度离心法
1
2
2
1
1
2000rpm 20min
1
1000rpm 3 3 3 10min
3
方 法
稀释的抗凝静脉血1ml 取一只玻璃试管，加入1ml淋巴细胞分离液；转移血标 本于淋巴细胞分离液上层（注意：保持液面完整) 离心，2000rpm，20min 吸取单个核细胞（中间白膜层），转移至一新试管中
加入5倍量D-Hank’s ，混匀，离心，1000rpm，10min
弃上清，留少许重悬沉淀 滴一滴细胞悬液于载玻片上，盖盖玻片，镜下观察
结 果
(一)
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
(二) 镜下观察结果
实验报告
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
方法、原理、步骤、结果
原 理
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 比重为1.077±0.001
红细胞、粒细胞比重1.09；
淋巴细胞和单核细胞的比重1.075
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
凝兔子外周血 淋巴细胞分离液 D-Hank’s液 试管、吸管等
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2020/12/12
14
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数
4
×104×2 （稀释倍数）
2020/12/12
15
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞 不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百 分率。
5
密度梯度离心原理
• 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定 离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降， 在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
• 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要 小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、 甘油；
• 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由 管口到管底逐步升高的密度梯度。
2020/12/12
活细胞百分率＝
活细胞数 总细胞数
×100％
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上。
2020/12/12
16
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
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密度梯度离心可用来分离核酸、蛋 白质、核糖体亚基及其它成分。
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密度梯度离心法
• 也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小 分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降 平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度 梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶 液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力 平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种 现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据 其差别进行分析的一种沉降平衡法。
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蔗糖密度梯度离心法
• 采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心 机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上 一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成 层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分， 就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码， 取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密 度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相 同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出 分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度 梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样 原理，也可使用分析超离心机进行测定。
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实验所需试剂的配置方法
一、Hank‘s液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl ： 8.0 克
KCl ： 0.4 克
Na２HPO４·12H２O ： 0.12 克
KH２HPO４：0.06克
分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hank‘s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝
人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 无菌干燥注射器针头。 血球计数板、显微镜、水平式离心机。 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
密度梯度离心法取单个核细胞
2020/• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
密度梯度离心法
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
三、注意事项 • 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 • 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细
胞数。 • 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的
增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
• 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相 应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
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分离活细胞的介质要求
• 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不 高；
• 2）PH中性或易调为中性； • 3）浓度大时渗透压不大； • 4）对细胞无毒。
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密度梯度离心法应用
• 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或 precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核 细胞（PBMC）。