密度梯度离心与差速离心
细胞分离常用方法
细胞分离常用方法细胞分离是生物学和医学研究中的基础技术之一，它可以将复杂的生物样品中的细胞分离出来，进而进行单细胞研究、细胞培养、细胞分析等进一步实验。
细胞分离的方法有很多种，可以根据研究目的和实验要求来选择合适的方法。
下面将介绍几种常用的细胞分离方法。
1.酶消化分离法：这种方法是通过使用特定的酶来消化组织或细胞间的连接物质，使细胞从组织中解离出来。
常用的酶有胰蛋白酶、胰酶、胶原酶、玉米胚胎蛋白酶等。
该方法适用于从组织中分离细胞，如从肝脏中分离肝细胞。
2.离心法：离心法是利用离心仪的离心力来分离细胞。
一般分为差速离心和密度梯度离心两种。
差速离心适用于分离不同大小和形状的细胞，如红细胞和白细胞的分离；而密度梯度离心适用于细胞的分子量和密度有明显差异的情况，如分离淋巴细胞、单核细胞等。
3.过滤法：过滤法是利用不同孔径的滤膜将样品中的细胞分离出来。
根据细胞大小的不同，可以选择不同孔径大小的滤膜，常见的有0.22μm的滤膜。
过滤法适用于细胞数目较多且大小相似的情况，如血液中的白细胞。
4.磁珠分离法：磁珠分离法是利用磁珠的特殊性质和磁场来分离细胞。
磁珠表面可以特异性地结合上其中一种特定分子，如抗体。
通过与标记有磁珠的抗体的结合，可以选择性地将含有特定表面标记的细胞分离出来。
这种方法可以用于对细胞表面标记的特异性分离，如肿瘤细胞的分离。
5.流式细胞术：流式细胞术是通过细胞在流动溶液中的特定速度和流体动力学效应来分离细胞。
这种方法需要将细胞样品悬浮在含有细胞染料的缓冲液中，经过专用的流式细胞术仪器进行分析。
根据细胞性状、大小和表面标记的不同，可以选择性地将不同细胞分离出来。
上述方法是几种常见的细胞分离方法，不同的方法适用于不同的细胞类型和实验要求。
除了上述方法外，还有其他一些特殊的细胞分离方法，如电泳法、免疫磁珠法等。
在选择细胞分离方法时，需要综合考虑细胞类型、实验目的和设备条件等因素，选择合适的分离方法。
差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察
差速离心㊁密度梯度离心㊁超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察罗靖莹ꎬ贺宏丽ꎬ郭阳ꎬ黄玮玮ꎬ黄晓波(电子科技大学附属医院/四川省人民医院ꎬ成都６１００７２)㊀㊀摘要:目的㊀观察差速离心㊁密度梯度离心㊁超滤离心技术在骨髓间充质干细胞(ＢＭＳＣｓ)外泌体提取中的应用ꎬ筛选外泌体最佳离心提取方法ꎮ方法㊀取ＢＭＳＣｓ培养４８ｈ后收集细胞上清ꎬ平均分成Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组ꎬ分别使用差速离心技术㊁密度梯度离心技术㊁超滤离心技术提取外泌体ꎻ记录各组外泌体提取时间ꎻ采用负染色技术观察各组外泌体形态ꎻ使用纳米颗粒跟踪分析仪测算各组外泌体浓度及大小ꎻ采用ＢＣＡ法测定外泌体总蛋白浓度ꎻ采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测各组外泌体表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘꎮ将肺微血管内皮细胞(ＰＭＶＥＣｓ)分成５组ꎬＥＣ组上室加入ＰＭＶＥＣｓ及培养基ꎻＬＰＳ组上室加入ＰＭＶＥＣｓ及含ＬＰＳ的培养基(构建内皮细胞损伤模型)ꎻＡ㊁Ｂ㊁Ｃ组上室加入方法同ＬＰＳ组ꎬ下室分别加入Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体ꎻ采用葡聚糖渗漏实验检测外泌体内皮细胞通透性(观察外泌体对内皮细胞的修复作用)ꎬ以内皮细胞通透指数表示ꎮ结果㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组的外泌体的提取时间分别为(１８０ʃ８)㊁(２０３ʃ１０)㊁(４０ʃ５)ｍｉｎꎬＡ㊁Ｂ组外泌体的提取时间与Ｃ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎮ各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ边界清晰ꎬ但仅Ａ组外泌体可见到典型的杯状结构ꎮＡ㊁Ｂ㊁Ｃ组的外泌体浓度分别为(４.４６ʃ０.３８)ˑ１０８/ｍＬ㊁(５.１１ʃ０.１６)ˑ１０８/ｍＬ㊁(２.１８ʃ０.１７)ˑ１０８/ｍＬꎬＡ㊁Ｂ组与Ｃ组外泌体浓度相比ꎬＰ均<０.０５ꎮＡ㊁Ｂ㊁Ｃ组的外泌体大小均为２０~１００ｎｍꎮＡ㊁Ｂ组外泌体总蛋白浓度及ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ的相对表达量均显著高于Ｃ组(Ｐ均<０.０５)ꎮＡ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁ＬＰＳ㊁ＥＣ组的内皮细胞通透指数分别为２.１７ʃ０.１５㊁１.７７ʃ０.３２㊁２.３７ʃ０.４２㊁２.９３ʃ０.１５㊁１.００ʃ０.００ꎬＡ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁ＬＰＳ组的内皮细胞通透指数与ＥＣ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎻＡ㊁Ｂ组的内皮细胞通透指数与ＬＰＳ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎮ结论㊀密度梯度离心技术虽耗时较长ꎬ但提取的外泌体纯度㊁浓度较高ꎬ对内皮细胞的修复作用较强ꎬ可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法ꎮ㊀㊀关键词:外泌体ꎻ外泌体提取方法ꎻ差速离心技术ꎻ密度梯度离心技术ꎻ超滤离心技术ꎻ间充质干细胞ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ肺微血管内皮细胞㊀㊀ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０１９.１２.０１３㊀㊀中图分类号:Ｒ３３㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０１９)１２￣００４８￣０５基金项目:四川省医学科学院 四川省人民医院青年博士基金(２０１５ＢＳ０７)ꎮ通信作者:黄晓波(Ｅ￣ｍａｉｌ:ｄｒｈｕａｎｇｘｂ＠１６３.ｃｏｍ)[１２]ＳｔｏｌｆＡＭꎬＣａｒｄｏｓｏＣＣꎬＡｃｃｏＡ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｌｙｍａｒｉｎｏｎｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｔｈｅｒＲｅｓꎬ２０１７ꎬ３１(３):３６６￣３７４.[１３]ＶｅｓｓａｌＧꎬＡｋｍａｌｉＭꎬＮａｊａｆｉＰꎬｅｔａｌ.Ｓｉｌｙｍａｒｉｎａｎｄｍｉｌｋｔｈｉｓｔｌｅｅｘｔｒａｃｔｍａｙｐｒｅｖｅｎｔｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙｉｎｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ[Ｊ].ＲｅｎＦａｉｌꎬ２０１０ꎬ３２(６):７３３￣７３９.[１４]ＳｈｅｅｌａＮꎬＪｏｓｅＭＡꎬＳａｔｈｙａｍｕｒｔｈｙＤꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｉｌｙｍａｒｉｎｏｎｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ￣ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙｉｎｒａｔｓ[Ｊ].ＩｒａｎＪＫｉｄｎｅｙＤｉｓꎬ２０１３ꎬ７(２):１１７￣１２３.[１５]张红ꎬ章向成ꎬ朱大龙.炎性反应与糖尿病肾病[Ｊ].国际内分泌代谢杂志ꎬ２０１５ꎬ３５(１):４９￣５２.[１６]ＮｇｕｙｅｎＤꎬＰｉｎｇＦꎬＭｕＷꎬｅｔａｌ.Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｈｕ￣ｍａｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ[Ｊ].Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ１１(３):２２６￣２３１.[１７]郑寿焕ꎬ金光明ꎬ柳明洙.ＣＤ１４启动子￣１５９位点基因多态性与糖尿病肾病的相关性研究[Ｊ].中华内分泌代谢杂志ꎬ２００９ꎬ２５(４):４０９￣４１１.[１８]ＷｕＣＨꎬＨｕａｎｇＳＭꎬＹｅｎＧＣ.Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ:ａｎｏｖｅｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｗｉｔｈａｎｔｉｇｌｙｃａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＡｎｔｉｏｘｉｄＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌꎬ２０１１ꎬ１４(３):３５３￣３６６.[１９]ＺｈａｎｇＨꎬＺｈａｎｇＲꎬＣｈｅｎＪꎬｅｔａｌ.Ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ１ｉｎ￣ｈｉｂｉｔｏｒｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄａｔｔｅｎｕａｔｅｓｋｉｄｎｅｙｉｎｊｕｒｙｉｎｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ[Ｊ].ＫｉｄｎｅｙＢｌｏｏｄＰｒｅｓｓＲｅｓꎬ２０１７ꎬ４２(５):８９４￣９０４.[２０]Ｇａｒｃｉａ￣ＧａｒｃｉａＰＭꎬＧｅｔｉｎｏ￣ＭｅｌｉａｎＭＡꎬＤｏｍｉｎｇｕｅｚ￣ＰｉｍｅｎｔｅｌＶꎬｅｔａｌ.Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪＤｉａｂｅｔｅｓꎬ２０１４ꎬ５(４):４３１￣４４３.[２１]ＦａｌｌａｈｚａｄｅｈＭＫꎬＤｏｒｍａｎｅｓｈＢꎬＳａｇｈｅｂＭＭꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｄｉ￣ｔｉｏｎｏｆｓｉｌｙｍａｒｉｎｔｏｒｅｎｉｎ￣ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｎｐｒｏｔｅｉｎｕ￣ｒｉａｉｎｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｖｅｒｔｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ:ａｒａｎｄｏｍ￣ｉｚｅｄꎬｄｏｕｂｌｅ￣ｂｌｉｎｄꎬｐｌａｃｅｂｏ￣ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌ[Ｊ].ＡｍＪＫｉｄｎｅｙＤｉｓꎬ２０１２ꎬ６０(６):８９６￣９０３.(收稿日期:２０１８￣１２￣０４)８４ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬａｎｄｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＬＵＯＪｉｎｇｙｉｎｇꎬＨＥＨｏｎｇｌｉꎬＧＵＯＹａｎｇꎬＨＵＡＮＧＷｅｉｗｅｉꎬＨＵＡＮＧＸｉａｏｂｏ(ＴｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｅｏｐｌｅ'ｓＨｏｓｐｉｔａｌꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００７２ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣｓ)ꎬａｎｄｔｏｆｉｎｄｏｕｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｍｅｔｈｏｄ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇｆｏｒ４８ｈꎬｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｏｆＢＭＳＣｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡꎬＢａｎｄＣ.Ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬａｎｄｕｌ￣ｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｒｅｃｏｒｄｅｄ.Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅꎻｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｓｉｚｅｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｎａｎｏｐａｒ￣ｔｉｃｌｅｔｒａｃｋｉｎｇａｎａｌｙｚｅｒꎻｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＢＣＡｍｅｔｈｏｄꎻｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓＣＤ９ꎬＣＤ６３ꎬＡｌｉｘｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ.Ｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ(ＰＭＶＥＣｓ)ｗｅｒｅｄｉ￣ｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓ.ＰＭＶＥＣｓａｎｄｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｕｐｐｅｒｃｈａｍｂｅｒｏｆｔｈｅＥＣｇｒｏｕｐ.ＰＭＶＥＣｓａｎｄＬＰＳ￣ｃｏｎｔａｉ￣ｎｉｎｇｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｕｐｐｅｒｃｈａｍｂｅｒｏｆｔｈｅＬＰＳｇｒｏｕｐ(ｔｈｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｊｕｒｙｍｏｄｅｌ)ꎻＴｈｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｕｐｐｅｒｃｈａｍｂｅｒｏｆｇｒｏｕｐｓＡꎬＢａｎｄＣｗｅｒｅｔｈｅｓａｍｅａｓｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅＬＰＳｇｒｏｕｐꎬａｎｄｔｈｅｌｏｗｅｒｃｈａｍｂｅｒｗａｓａｄｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｄｅｘｔｒａｎｌｅａｋａｇｅｔｅｓｔ(ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｒｅｐａｉｒｍｅｎｔｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ).Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡꎬＢａｎｄＣｗａｓ(１８０ʃ８)ꎬ(２０３ʃ１０)ａｎｄ(４０ʃ５)ｍｉｎꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡａｎｄＢｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｇｒｏｕｐＣ(Ｐ<０.０５).ＴｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｅｌｌｉｐｔｉｃａｌｏｒｃｉｒｃｕｌａｒｍｅｍｂｒａｎｏｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｖａｒｙｉｎｇｓｉｚｅｓｗｉｔｈｃｌｅａｒｂｏｕｎｄａｒｉｅｓꎬｂｕｔｏｎｌｙｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐＡꎬｗｅｆｏｕｎｄｔｙｐｉｃａｌｃｕｐ￣ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ.Ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｃｏｎｃｅｎ￣ｔｒａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡꎬＢꎬａｎｄＣｗｅｒｅ(４.４６ʃ０.３８)ˑ１０８/ｍＬꎬ(５.１１ʃ０.１６)ˑ１０８/ｍＬꎬａｎｄ(２.１８ʃ０.１７)ˑ１０８/ｍＬꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅ２０ｔｏ１００ｎｍｉｎｓｉｚｅ.ＴｈｅｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＤ６３ａｎｄＡｌｉｘｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡａｎｄＢｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐＣ(ａｌｌＰ<０.０５).ＴｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｄｅｘｅｓｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡꎬＢꎬＣꎬＬＰＳｇｒｏｕｐａｎｄＥＣｇｒｏｕｐｗｅｒｅ２.１７ʃ０.１５ꎬ１.７７ʃ０.３２ꎬ２.３７ʃ０.４２ꎬ２.９３ʃ０.１５ꎬａｎｄ１.００ʃ０.００ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｇｒｏｕｐＥＣａｎｄｇｒｏｕｐｓＡꎬＢꎬＣａｎｄＬＰＳ(ａｌｌＰ<０.０５)ａｓｗｅｌｌａｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｇｒｏｕｐＬＰＳａｎｄｇｒｏｕｐｓＡａｎｄＢ(Ｐ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｉｔｔａｋｅｓａｌｏｎｇｅｒｔｉｍｅｆｏｒｄｅｎ￣ｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｅｘｔｒａｃｔｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓꎬｂｕｔｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｅｘｏｓｏｍｅｓｈａｖｅｈｉｇｈｅｒｐｕｒｉｔｙꎬｃｏｎｃｅｎｔｒａ￣ｔｉｏｎꎬａｎｄｓｔｒｏｎｇｅｒｒｅｐａｉｒｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｕｌｄｂｅａｐｒｅ￣ｆｅｒｒｅｄｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｅｘｏｓｏｍｅｓꎻｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｅｔｈｏｄꎻｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎻｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎻｕｌｔｒａ￣ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎻｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓꎻｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓꎻｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅ￣ｌｉａｌｃｅｌｌｓ㊀㊀间充质干细胞(ＭＳＣｓ)作为一种具有多向分化潜能的细胞ꎬ因其在再生医学领域和临床试验中对各种疾病的治疗效果受到广泛关注ꎮ骨髓间充质干细胞(ＢＭＳＣｓ)常被作为细胞再生的理想供体细胞ꎬ主要的作用机制包括归巢㊁调节免疫㊁转分化及旁分泌[１~４]ꎮ外泌体是一种由脂质双分子层包裹的膜性囊泡ꎬ大小通常在２０~１００ｎｍꎮ研究[５~９]显示ꎬ外泌体广泛存在于尿液㊁胸腹腔积液㊁乳汁㊁唾液等体液中ꎬ而且很多细胞可以分泌外泌体ꎬ如ＭＳＣｓ㊁血细胞㊁内皮细胞㊁神经细胞㊁肿瘤细胞等ꎻ外泌体内含有各种蛋白质㊁脂类和ｍＲＮＡ㊁ｍｉＲＮＡ㊁ＤＮＡ片段等遗传物质ꎬ细胞间可以通过外泌体交换信息㊁相互作用ꎬ且免疫排斥风险较低ꎬ在各种病理状态及炎症反应中发挥着重要的作用ꎮ内皮细胞和上皮细胞受损是炎症反应中至关重要的环节ꎬ已证实ＭＳＣｓ可以通过外泌体修复受损的内皮细胞[１０]ꎮ外泌体体积小且不稳定ꎬ因此如何快速有效地分离和提取外泌体是目前面临的主要挑战ꎮ分离和提取外泌体的方９４法主要有离心法㊁免疫磁珠法㊁ＰＥＧ沉淀法㊁试剂盒法等ꎬ其中常用的离心法主要有差速离心技术㊁密度梯度离心技术和超滤离心技术[１１]ꎮ差速离心技术主要是依据粒子大小和密度设置不同的离心力ꎬ通过平衡沉降原理来分离外泌体ꎮ密度梯度离心技术通常采用蔗糖作为分离介质ꎬ与重水一起配置成１.１~１.１９ｇ/ｍＬ的密度垫ꎬ根据不同沉降系数物质在离心力作用下的分层分布ꎬ以此分离出外泌体[１２]ꎮ超滤离心技术是在一定压力下使溶质通过不同孔径的滤膜ꎬ从而筛选出外泌体ꎮ２０１８年６月２日~２０１８年９月１日ꎬ本研究观察了差速离心㊁密度梯度离心㊁超滤离心技术在ＢＭＳＣｓ外泌体提取中的应用ꎬ筛选外泌体最佳离心提取方法ꎮ１ 材料与方法１.１㊀细胞㊁试剂及仪器㊀ＢＭＳＣｓ㊁肺微血管内皮细胞(ＰＭＶＥＣｓ)购自美国ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ公司ꎬＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基㊁胎牛血清(ＦＢＳ)购自美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎬ抗ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ㊁ＧＡＰＤＨ购自Ｒ＆Ｄ公司ꎬ山羊抗兔ＩｇＧ￣ＨＲＰ㊁山羊抗鼠ＩｇＧ￣ＨＲＰ购自美国Ａｂｃａｍ公司ꎬＢＣＡ蛋白试剂盒购自凯基公司ꎬ透射电子显微镜购自Ｐｈｉｌｉｐｓ公司ꎬ细胞恒温培养箱购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎬ超速离心机购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎬ荧光酶标仪购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎮ１.２㊀细胞培养㊁分组及外泌体的提取㊀ＢＭＳＣｓ㊁ＰＭＶＥＣｓ分别在３７ħ㊁５％ＣＯ２细胞培养箱中ꎬ用含有１０％胎牛血清(ＦＢＳ)和５％双抗的ＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基进行培养ꎮ取第４~５代ＢＭＳＣｓ培养至６０％~７０％融合时ꎬ更换为无血清培养基ꎬ继续培养４８ｈ后收集细胞上清３６０ｍＬꎬ平均分成Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组ꎬ每组１２０ｍＬꎬ分别使用差速离心技术㊁密度梯度离心技术㊁超滤离心技术提取外泌体ꎮ记录各组外泌体提取时间ꎮ①差速离心技术提取外泌体ꎮ取Ａ组细胞上清以３０００ˑｇ离心２０ｍｉｎꎬ去除细胞碎片和大分子物质ꎬ在４ħ条件下１０００００ˑｇ离心６０ｍｉｎꎬ弃上清ꎬ加入４ħ的ＰＢＳ重悬ꎬ然后在４ħ条件下１０００００ˑｇ离心６０ｍｉｎꎬ将沉淀物用２００μＬ预冷的ＰＢＳ重悬ꎬ用０.２２μｍ滤过膜过滤ꎬ即得ＢＭＳＣｓ外泌体ꎮ②密度梯度离心技术提取外泌体ꎮ取Ｂ组细胞上清以３００ˑｇ离心１０ｍｉｎꎬ去除细胞碎片和大分子物质ꎬ１００００ˑｇ离心３０ｍｉｎꎬ去除微泡ꎬ延离心管壁缓慢加入４ｍＬ３０％蔗糖溶液ꎬ形成一单层ꎬ在４ħ条件下１０００００ˑｇ离心９０ｍｉｎꎬ弃上清ꎬ将蔗糖层重悬于ＰＢＳ中ꎬ再在４ħ条件下１０００００ˑｇ离心９０ｍｉｎꎬ将获得的沉淀物重悬于２００μＬ预冷的ＰＢＳ中ꎬ即得ＢＭＳＣｓ外泌体ꎮ③超滤离心技术提取外泌体ꎮ在超滤离心管中加入ＰＢＳ缓冲液ꎬ室温条件下３０００ˑｇ离心１５ｍｉｎꎬ去除甘油和其他保存剂ꎻ取Ｃ组细胞上清以１７０００ˑｇ离心１５ｍｉｎꎬ然后加入超滤离心管中以３０００ˑｇ离心３０ｍｉｎꎬ用２００μＬＰＢＳ重悬超滤膜上的沉淀物ꎬ即得ＢＭＳＣｓ外泌体ꎮ１.３㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体形态观察㊀采用负染色技术ꎮ向载样铜网上分别加入提取的Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体混悬液２０μＬꎬ室温静置３ｍｉｎ后用滤纸吸干液体ꎬ再加入３０μＬ的３％磷钨酸溶液负染５ｍｉｎꎬ滤纸吸干㊁晾干ꎬ透射电镜下观察各组外泌体形态ꎮ１.４㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体浓度及大小测算㊀取Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体悬液１００μＬ稀释于２ｍＬＰＢＳ内ꎬ使用纳米颗粒跟踪分析仪(Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ)测算各组外泌体浓度ꎬ并根据每个粒子的布朗运动与斯托克斯￣爱因斯坦(Ｓｔｏｋｅｓ￣Ｅｉｎｓｔｅｉｎ)方程测算各组外泌体大小ꎮ１.５㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体总蛋白及表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ的检测㊀①采用ＢＣＡ法测定Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体总蛋白浓度ꎮ②采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘꎮ取Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体悬液１００μＬꎬ加入ＲＩＰＡ裂解液于冰上裂解１０ｍｉｎꎬ使用超声破碎外泌体后于４ħ条件下１５０００ˑｇ离心１０ｍｉｎꎬ制得各组外泌体蛋白样本ꎮ取各组外泌体蛋白样本与上样缓冲液混合煮沸５ｍｉｎ使蛋白变性ꎬ然后进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ半干时转至ＰＶＤＦ膜上ꎬ用５％脱脂奶粉封闭ꎬ加入一抗ꎬ４ħ过夜ꎬＴＢＳＴ清洗３次ꎬ加入相应二抗ꎬ室温孵育１ｈꎬＴＢＳＴ清洗３次ꎬ以ＧＡＰＤＨ为内参ꎬＥＣＬ化学发光系统检测各组外泌体表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ灰度值ꎬ计算各组外泌体表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ的相对表达量ꎮ外泌体表面标志蛋白的相对表达量＝外泌体表面标志蛋白灰度值/ＧＡＰＤＨ灰度值ꎮ１.６㊀外泌体内皮细胞通透性检测㊀采用１００ｎｇ/ｍＬ的脂多糖(ＬＰＳ)干预ＰＭＶＥＣｓ６ｈ构建内皮细胞损伤模型ꎮ采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室进行葡聚糖渗漏实验ꎮ将ＰＭＶＥＣｓ分成５组ꎬＥＣ组上室加入１ˑ１０５个ＰＭＶＥＣｓ以及１００μＬ完全培养基ꎻＬＰＳ组上室加入１ˑ１０５个ＰＭＶＥＣｓ以及１００μＬ含１００ｎｇ/ｍＬＬＰＳ的完全培养基ꎻＡ㊁Ｂ㊁Ｃ组上室加入方法０５同ＬＰＳ组ꎬ下室分别加入Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体１００μｇꎬ用不含酚红㊁血清的培养基重悬至４００μＬꎮ各组上室弃上清ꎬ加入不含酚红㊁血清的培养基配制的ＦＩＴＣ￣葡聚糖(４０ｋＤａꎬ０.５ｍｇ/ｍＬ)１００μＬꎬ下室加入等浓度无ＦＩＴＣ标记的葡聚糖１００μＬꎬ３７ħ㊁５％ＣＯ２㊁避光条件下培养４０ｍｉｎꎬ吸取上㊁下室液体各１００ｕＬꎬ在激发光波长４９０/４８５ｎｍ㊁发射光波长５２５/５３０ｎｍ处ꎬ采用荧光酶标仪检测荧光强度ꎬ计算内皮细胞通透系数ꎮ内皮细胞通透系数＝([Ａ]/ｔ)ˑ(１/Ａ)ˑ(ｖ/[Ｌ])ꎮ其中[Ａ]为下室荧光强度ꎻｔ为时间ꎬ单位为ｓꎻＡ为滤过面积ꎬ单位为ｃｍ２ꎻｖ为下室液体量ꎻ[Ｌ]为上室荧光强度ꎮ各组外泌体内皮细胞通透性以各组内皮细胞通透指数表示ꎮ各组内皮细胞通透指数＝各组内皮细胞通透系数/ＥＣ组内皮细胞通透系数ꎮ１.７㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ２０.０统计软件ꎮ计量资料以 ｘʃｓ表示ꎬ比较用单因素方差分析ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体提取时间比较㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组的外泌体的提取时间分别为(１８０ʃ８)㊁(２０３ʃ１０)㊁(４０ʃ５)ｍｉｎꎬＡ㊁Ｂ组外泌体的提取时间与Ｃ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎻＡ组外泌体的提取时间与Ｂ组相比ꎬＰ>０.０５ꎮ２.２㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体形态比较㊀如图１所示ꎬ各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ边界清晰ꎬ但仅Ａ组外泌体可见到典型的杯状结构ꎮ图１㊀透射电镜下各组外泌体形态２.３㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体浓度及大小比较㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组的外泌体浓度分别为(４.４６ʃ０.３８)ˑ１０８/ｍＬ㊁(５.１１ʃ０.１６)ˑ１０８/ｍＬ㊁(２.１８ʃ０.１７)ˑ１０８/ｍＬꎬＡ㊁Ｂ组与Ｃ组外泌体浓度相比ꎬＰ均<０.０５ꎻＡ组与Ｂ组外泌体浓度相比ꎬＰ>０.０５ꎮＡ㊁Ｂ㊁Ｃ组的外泌体大小均为２０~１００ｎｍꎮ２.４㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体总蛋白浓度及表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ的表达比较㊀如表１所示ꎬＡ㊁Ｂ组外泌体总蛋白浓度及ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ的相对表达量均显著高于Ｃ组(Ｐ均<０.０５)ꎮ表１㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组外泌体表面标志蛋白ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘ的表达比较( ｘʃｓ)组别总蛋白(μｇ/ｍＬ)ＣＤ９ＣＤ６３ＡｌｉｘＡ组３３１.３３ʃ２４.１７﹡６.４７ʃ１.０７１８.４７ʃ０.８３﹡２６.７３ʃ０.７６﹡Ｂ组３５０.０６ʃ３０.７４﹡７.４０ʃ０.５６２６.３０ʃ０.８２﹡３７.７０ʃ２.６５﹡Ｃ组１９８.４２ʃ１８.９６５.５３ʃ１.１９９.７５ʃ０.４４１８.１３ʃ１.２７㊀㊀注:与Ｃ组相比ꎬ﹡Ｐ<０.０５ꎮ２.５㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁ＬＰＳ㊁ＥＣ组内皮细胞通透指数比较㊀Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁ＬＰＳ㊁ＥＣ组内皮细胞通透指数分别为２.１７ʃ０.１５㊁１.７７ʃ０.３２㊁２.３７ʃ０.４２㊁２.９３ʃ０.１５㊁１.００ʃ０.００ꎬＡ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁ＬＰＳ组的内皮细胞通透指数与ＥＣ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎻａ㊁ｂ组的内皮细胞通透指数与ＬＰＳ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎻ其余各组间相比ꎬＰ均>０.０５ꎮ３㊀讨论㊀㊀ＢＭＳＣｓ是成体干细胞的一种ꎬ具有高度自我更新能力和多向分化潜能ꎬ且具有免疫调节作用ꎬ是组织工程学中常用的种子细胞ꎬ其对临床上常见的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征㊁心肌梗死㊁糖尿病㊁肝肾功能衰竭等多种疾病的治疗效果受到了广泛的关注ꎮ随着研究的深入进展ꎬ研究人员发现ＭＳＣｓ主要是通过旁分泌机制进行组织器官的保护[１３]ꎮ胞外囊泡(ＥＶ)被认为是细胞间信息交流和物质传递的新机制[１４]ꎮ根据粒径大小和分泌机制的不同ꎬＥＶ可分为１００~１０００ｎｍ的微泡(ＭＶ)和２０~１００ｎｍ的外泌体ꎮ研究[１５]显示ꎬ外泌体易获取㊁易储存ꎬ无致瘤性ꎬ在再生医学㊁器官移植㊁疾病诊断和药物传递等方面发挥了不可或缺的作用ꎬ但目前并无标准的分离提取技１５术ꎬ如何提高浓度㊁保证纯度㊁维持活性㊁节约时间ꎬ是目前临床亟需解决的问题ꎮ㊀㊀本研究首先采用差速离心技术㊁密度梯度离心技术和超滤离心技术提取ＢＭＳＣｓ外泌体ꎬ随后对分离提取的外泌体进行了比较ꎮ各组外泌体提取时间对比显示ꎬ超滤离心技术提取外泌体用时最少ꎻ通过透射电镜和Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ观察到ꎬ３种方法均可以分离出大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ大小在２０~１００ｎｍꎻ通过ＢＣＡ蛋白定量法和ＮＴＡ公式计算出ꎬ密度梯度离心技术提取的外泌体总蛋白和外泌体浓度最高ꎬ差速离心技术其次ꎬ超滤离心技术最低ꎻ３种方法提取的外泌体均可表达特异性表面标志物ＣＤ９㊁ＣＤ６３㊁Ａｌｉｘꎬ差速离心技术和密度梯度离心技术ＣＤ６３和Ａｌｉｘ的表达明显高于超滤离心技术ꎬ说明超滤离心技术分离出来的外泌体浓度和纯度均较低ꎮ㊀㊀ＰＭＶＥＣｓ既是急性肺损伤时的受害者ꎬ也是启动者ꎬ在急性呼吸窘迫综合征(ＡＲＤＳ)发生时ꎬＰＭ￣ＶＥＣｓ的通透性显著升高ꎮ本研究通过ＬＰＳ干预ＰＭＶＥＣｓ构建了内皮细胞损伤模型ꎬ观察各离心技术提取的外泌体对受损内皮细胞的修复作用ꎬ结果显示ꎬ与ＬＰＳ组相比ꎬＡ㊁Ｂ组外泌体内皮细胞通透指数显著下降ꎬ说明差速离心技术和密度梯度离心技术提取的外泌体具有更强的内皮细胞修复能力ꎬ可能与差速离心技术和密度梯度离心技术提取的外泌体浓度和纯度更高有关ꎬ但后期仍需研究更多的内皮细胞功能实验验证ꎮ㊀㊀差速离心技术步骤简单ꎬ产物纯度高ꎮ但差速离心技术也有一定的缺点ꎬ反复的离心提纯过程会造成外泌体丢失及影响囊膜的完整性ꎬ且易形成聚合物[１６]ꎻ密度梯度离心技术提取产物更纯ꎬ且不影响外泌体的活性ꎬ但是准备工作繁琐ꎬ程序复杂且耗时长ꎮ超滤离心技术过程简单㊁速度快ꎬ但可能存在杂蛋白污染ꎬ部分外泌体也可能黏附于滤膜上导致产物损失以及活性丧失[１７]ꎮ㊀㊀综上所述ꎬ密度梯度离心技术虽耗时较长ꎬ但提取的外泌体纯度㊁浓度较高ꎬ对内皮细胞的修复作用较强ꎬ可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法ꎮ参考文献:[１]ＥｓｒｅｆｏｇｌｕＭ.Ｒｏｌｅｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｒｅｐａｉｒｏｆｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ:ｅｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｂｅｎｅｆｉｔｏｆｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｎｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌꎬ２０１３ꎬ１９(４０):６７５７￣６７７３. 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细胞离心方法和原理
离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。
密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
高中课本中涉及离心技术比较
高中课本中涉及离心技术比较离心技术：是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。
功能：Ø分离、纯化样品;Ø对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
主要分两种类型：制备性离心技术和分析性离心技术一、制备性离心技术：是以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。
1、差速离心法（差速沉降离心法）Cellhomogenate细胞匀浆pelletcontains颗粒包含nucleicytoskeletons细胞骨架mitochondriallysosomes peroxisomes线粒体溶酶体过氧化物酶体microsomessmall vesicles 微粒小囊泡ribosomesviruses large macromolecules核糖体病毒大分子fractionation高中课本涉及的细胞器的获取分离通过差速离心法获得。
2、密度梯度离心法（密度梯度区带离心法）此法可以用于DNA复制分离、病毒颗粒的分离等。
二、分析性超速离心技术：与制备性超速离心不同的是：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。
因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。
分析性超速离心的应用：⒈测定生物大分子的相对分子重量测定相对分子重量主要有三种方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。
其中应用最广的是沉降速度，超速离心在高速中进行，这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标，然后用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。
⒉生物大分子的纯度估计静分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA 制剂、病毒和蛋白质的纯度。
用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。
差速离心法和密度梯度离心法的区别
差速离心法和密度梯度离心法的区别教学问题：高中生物必修1中研究细胞器的分离方法是差速离心法，必修2中研究DNA复制方式——半保留复制的方法是密度梯度离心法，两者之间有什么区别？一、差速离心法差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
1．工作原理通常两个组分的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。
例如某样品中有大、中、小三个组分，用差速离心法分离时，把样品放在离心管内，先按大组分的沉降系数选择离心转速和离心时间，当离心结束时正好使大组分全部沉降到离心管底部，这时中小组分中的一部分也会沉降到底部。
若原始样品液中三个组分的含量相等，则在原始样品液中大组分占总组分量的三分之一。
通过一次离心后分离出的大组分沉淀占总组分量约90%。
如要进一步提纯可以把此沉淀物再溶解，再按大组分的沉降条件离心，得到大组分的第二次离心沉淀。
通过多次对沉淀和上清液差速离心，可以把三个沉降系数有差别的组份分离提纯，所以这个方法又称为分步离心法。
2．差速离心法的优缺点差速离心法的优点是样品的处理量较大，可用于大量样品的初分离。
其缺点是分离复杂样品和要求分离纯度较高时，离心次数多，操作繁杂。
由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中间损失，所以离心分辨力差。
实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染，对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯。
产品的纯度和回收率都达不到上述理论值。
因此差速离心法主要用于大量样品的初步分离提纯。
二、密度梯度离心法密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。
离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。
1．工作原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
细胞离心方法和原理
离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。
密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
密度梯度离心与差速离心的区别
密度梯度离心与差速离心的区别
密度梯度离心属于密度萃取，是根据溶质和溶液的密度差异来实现分离的，是在高细胞压力的作用下，在容积较大的离心管中利用液体单位体积的重量（密度）差异进行分离；而差速离心是基于离心力的不同，即根据溶质的分子量和浓度的差异，从而使得这一溶液的相对离心力差异改变而实现分离，利用的是两液体的离心力差异。
2、分离效率不同
密度梯度离心的效率一般比较低，它主要利用液体单位体积的重量差异，物质分子量的差异较小，溶液浓度的差异也较小，因此分离效率不会高。
而差速离心可以实现高密度的湍流而高速度的分离，分离效率更高。
三、应用不同
密度梯度离心主要用于对分子量大的物质进行分离，如生物体分离，尤其是细胞分离，可以达到更高的精度；而差速离心可以用于分离分子量小的有机物，如分离水溶性有机物、抗体和抗原之间的结合等。
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密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别
密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别密度梯度离心和密度梯度超速离心都是常用的分离技术，它们的区别主要在于离心过程中的离心力不同。
密度梯度离心是利用不同密度物质之间的分层原理进行分离的。
在离心过程中，样品被加入密度梯度液体中，高密度的样品会沉降到离心管底部，低密度的样品则会浮在液面上。
这种离心方式适用于分离不同密度的生物分子和细胞器，如蛋白质、RNA、DNA、细胞核等。
密度梯度超速离心是在密度梯度离心的基础上进一步加速离心
过程，以达到更高的离心力。
在离心过程中，样品受到的离心力大于常规离心，由于惯性力的作用，会引起样品中分子的离心沉积。
这种离心方式适用于分离高分子量的生物分子，如蛋白质复合物、病毒等。
因此，密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别在于离心过程中的离心力和适用范围。
选择合适的离心方式可以帮助科研人员更好地分离和提取样品中的目标物质。
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密度梯度离心与差速离心
离心技术是一种常用于分离混合物中成分的方法。
其中，密度梯度离心和差速离心是两种常见的离心方式。
密度梯度离心是利用不同密度的物质在离心管中分层的原理，将混合物分层分离的方法。
这种离心方法广泛应用于生物化学、生物医学和生命科学的研究中。
其原理是利用离心管中不同密度的物质在离心过程中受到的离心力不同，从而分层分离出各种不同密度的成分。
该方法需要在离心管中加入不同密度的稳定梯度物质，如葡萄糖、碘化物或硝酸铊等，以形成密度梯度。
混合物放置在梯度物质上，离心过程中，样品中的成分会被分层到不同的密度梯度上，从而实现分离。
差速离心是一种离心方法，它通过调节不同速度的旋转离心管来分离混合物中的成分。
该方法适用于分离大小和密度不同的颗粒物质，如细胞、细胞器和病毒等。
差速离心的原理是将混合物放置在离心管中，以一定的速度离心，根据颗粒物质的大小和密度不同，颗粒物质会被分离到不同的位置。
通过调节离心管旋转速度和时间，可以实现不同颗粒物质的分离。
密度梯度离心和差速离心都是离心技术中常用的方法。
两种方法的原理和应用有所不同，需要根据具体的实验目的和样品特性选择适合的离心方法。
在实际应用中，密度梯度离心和差速离心常常结合
使用，以实现更加精确的分离和纯化。
离心技术是一种非常重要的分离方法，密度梯度离心和差速离心是其中比较常用的两种方法。
密度梯度离心适用于分离密度不同的成分，而差速离心适用于分离大小和密度不同的颗粒物质。
在实际应用中，两种方法常常结合使用，以实现更加精确的分离和纯化。