细胞培养
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。
3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
简述细胞培养一般步骤
简述细胞培养一般步骤
细胞培养一般包括以下步骤:
1. 准备工作:准备细胞培养所需的器材、设备、培养基等。
2. 细胞筛选:选择适合培养的细胞类型,如哺乳动物细胞、植物细胞等。
3. 细胞预处理:对细胞进行清洗、消毒、pH 值调整等预处理,使细胞处于适宜培养的状态。
4. 细胞接种:将预处理后的细胞导入培养皿或培养基中,并轻轻振动培养皿,使细胞均匀分布。
5. 维持细胞生长:通过控制温度、光照、营养供应等因素,维持培养环境的稳定性,促进细胞生长。
6. 培养和观察:将培养皿放入培养箱中,维持合适的培养条件,等待细胞生长和分裂。
通过观察细胞形态、增殖、分化等特性,可以确定细胞培养的效果。
7. 分离和纯化:通过离心、过滤等操作,将培养细胞分离出来,进行进一步处理和纯化,以便用于实验或生产。
细胞培养是一项复杂的过程,需要经过多次实验和调整,才能培养出符合要求的细胞。
细胞培养定义-概述说明以及解释
细胞培养定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞培养是一种重要的科学技术，用于在控制的实验室条件下，培养细胞体外生长和增殖。
通过提供合适的生长环境，包括适当的培养基、细胞状态维持剂和温度、湿度等因素的控制，细胞可以持续生长和繁殖。
细胞培养可以在无菌环境下进行，以保证培养过程中没有污染物的引入。
细胞培养的主要目的是研究细胞的特性和功能。
通过细胞培养，科学家可以观察和研究细胞在不同条件下的行为，进一步了解细胞的基本生理过程、信号转导途径和分化过程。
此外，细胞培养还被广泛应用于药物筛选、生物技术研究、生物工程和医药领域等。
细胞培养的发展历史可以追溯到19世纪末。
当时，人们开始尝试培养动物细胞，最早成功地实现了培养培养出鸟胚细胞。
经过长期的努力和技术改进，细胞培养的技术逐渐成熟，并被广泛应用于各个领域。
综上所述，细胞培养是一种重要的科学技术，通过在受控的实验室条件下培养细胞，可以研究细胞的特性和功能。
随着细胞培养技术的不断发展和完善，它在生物学研究、生物技术和医药领域的应用将会更加广泛。
1.2文章结构1.2 文章结构本文旨在探讨细胞培养的定义、历史、重要性以及应用领域。
为了更好地展示这些内容，本文将按照以下结构进行组织和展示：第一部分是引言部分，引言部分将对细胞培养进行概述。
我们将介绍细胞培养的基本概念，其在生物科学中的重要性以及本文的目的。
第二部分是正文部分，正文部分将分为两个小节。
首先，我们将详细介绍细胞培养的定义。
我们将解释什么是细胞培养，如何进行细胞培养以及细胞培养的目的和意义。
其次，我们将回顾细胞培养的历史，探讨细胞培养技术的发展和重要里程碑，以及这些里程碑对现代细胞培养的影响。
第三部分是结论部分，结论部分将总结细胞培养的重要性和应用领域。
我们将强调细胞培养在生命科学研究中的关键作用，并讨论细胞培养在医学、药物研发、生物工程等领域的广泛应用。
通过以上的文章结构，我们将全面、系统地介绍细胞培养的定义、历史、重要性和应用领域。
细胞培养方法
细胞培养方法
细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以提供大量的细胞用于实验研究。
正确的细胞培养方法对于细胞的生长、增殖和实验结果的准确性都至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法及注意事项。
首先，准备培养基。
培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长因子的混合物。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据不同细胞类型的要求选择适当的培养基。
在制备培养基时，需要注意无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
其次，处理细胞。
从细胞库中取出细胞后，需要进行细胞的处理和传代。
处理细胞时，要注意细胞的密度和活性，避免细胞凝集和死亡。
传代时，要根据细胞的生长状态和密度进行适当的稀释，以保证细胞的健康生长。
接着，进行细胞的接种和培养。
将处理好的细胞按照一定的比例接种到预先涂有培养基的培养皿中，然后将培养皿放入培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态，及时更换培养基，避免细胞过度生长或死亡。
最后，进行实验。
当细胞达到所需的数量和状态后，就可以进行相关的实验。
在实验过程中，需要注意培养皿的无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
同时，要注意细胞的处理和操作方法，避免对细胞造成损伤。
总之，正确的细胞培养方法对于细胞的生长和实验结果至关重要。
只有严格遵守操作规程，做好无菌操作，才能得到可靠的实验结果。
希望本文介绍的细胞培养方法能够对大家有所帮助。
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
【1】细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是生物学实验中常见的一项重要技术，它广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
通过细胞培养，科研人员能够研究细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程，同时也可以进行药物筛选、生物学效应观察等实验。
然而，细胞培养是一项复杂的工作，需要严格遵循一系列步骤和要求，并且需谨慎对待各项注意事项。
在本文中，我将以从浅入深的方式，全面探讨细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项，帮助你更深入地理解这一技术。
【2】细胞培养的具体步骤和要求让我们来了解细胞培养的具体步骤。
通常情况下，细胞培养的主要步骤包括：细胞分离、细胞计数、细胞传代、培养基准备、细胞接种、培养条件控制等。
具体来说，细胞培养的步骤包括收获细胞、细胞解聚、细胞计数、调整细胞密度、接种细胞、培养细胞、处理细胞等。
在进行这些步骤时，需要保持实验操作台面清洁整洁，常备所需培养工具、培养耗材和培养试剂，并且要准确记录实验过程中的重要参数和数据。
细胞培养的要求也是至关重要的。
要选择合适的细胞系，确保来源纯净、鉴定正确、培养活力好。
培养基的选用也十分重要，要根据不同细胞类型的需求来选择适当的培养基，并添加必要的生长因子、氨基酸、维生素等。
培养条件的控制也十分重要，包括温度、湿度、二氧化碳浓度、通风情况等。
细胞培养的灭菌和无菌操作更是必不可少，细胞培养过程中的任何污染都可能对实验结果产生影响。
【3】细胞培养的注意事项在进行细胞培养时，需要特别注意一些细节和注意事项。
要保持室内整洁，操作台面、培养箱、生物安全柜等工作台要保持干净，并且要经常消毒。
要做好个人防护工作，戴口罩、手套、工作服等，避免人体细胞对培养的影响。
要定期检查培养箱、生物安全柜等设备的运行情况，确保培养环境的稳定性和安全性。
对细胞的培养时间、传代次数、细胞密度等也需要严格控制，不可随意增加培养时间或传代次数，以免细胞出现突变或异常。
【4】对细胞培养的个人观点和理解从事细胞培养工作多年，我深知细胞培养的重要性和复杂性。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养是一种将动植物细胞在体外条件下进行繁殖和生长的技术。
它是许多生物学研究和应用领域的重要工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药物研发、生物工程等领域。
细胞培养的工作流程包括以下几个主要步骤：2.细胞株的建立：细胞株是一组具有相同遗传特性的细胞，通常可以通过原代培养、扩增和传代等方法建立。
原代细胞通常来自新鲜组织，将其接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中，细胞在适宜条件下会开始生长和分裂形成细胞株。
3.细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长和繁殖所需的营养物和生长因子的培养介质。
根据不同细胞类型的要求，可以选择不同的培养基配方。
培养基常见的成分包括无菌水、氨基酸、糖类、脂质、无菌血清、维生素等。
4.细胞的传代：细胞在培养皿中进行繁殖和分裂，当细胞密度达到一定程度时，需要将细胞进行传代以保持细胞的健康和增殖能力。
传代的目的是将细胞分离并分散在新的培养皿中，以便细胞可以继续生长和繁殖。
5.细胞的准备和植入：根据实验设计和研究目的，将所需的细胞接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中。
细胞培养条件通常包括适宜温度（通常为37摄氏度）、无菌条件、恒定的pH值、适宜的气氛（如5%CO2），以及提供细胞所需的营养物和生长因子。
6.细胞的观察和维护：细胞在培养过程中需要定期观察其生长状态和形态特征。
可以使用显微镜对细胞进行观察和记录，以判断细胞的健康和增殖情况。
细胞的培养过程中还需要定期更换培养基，补充营养物和生长因子，以维持细胞的正常生长和繁殖。
7.细胞的实验应用：培养的细胞可以用于各种不同的实验研究和应用，包括细胞分离、细胞特征分析、药物筛选、基因表达研究等。
在实验中，细胞可能需要通过一些特殊处理，如细胞冻存、细胞分离、染色等。
细胞培养的基本原理是
细胞培养的基本原理是细胞培养的基本原理是将动植物等有机体的细胞或组织放入具有适宜细胞生长环境的培养基中，通过维持适宜的生理环境，提供足够的营养物质和生长因子，使细胞能够生长、分裂和分化，最终形成一个细胞群落或组织，在体外模拟生物体内的生长和发育过程。
细胞培养的基本原理包括以下几个方面：1. 细胞的提取和分离：细胞培养的首要步骤是从体内组织中取得细胞，可以通过机械剪切、消化酶解、梯度离心等方法将细胞从组织中分离出来。
经过适当处理后，获得的单细胞悬浮液可以用于细胞培养。
2. 培养基的制备：培养基是细胞培养中必不可少的基础，它需要提供足够的营养物质和生长因子以满足细胞生长的需求。
常用的培养基主要包括基本培养基和补充剂两部分。
基本培养基一般包含无机盐、氨基酸、维生素等基础营养物质，而补充剂则根据不同类型的细胞培养需求添加适宜的因子，如人类胚胎成纤维细胞培养基中添加胎血清和胰岛素。
3. 细胞的培养条件控制：细胞培养需要提供适宜的环境条件，包括温度、湿度、气体氛围和酸碱度等。
一般情况下，培养温度控制在37左右，湿度保持在90%以上，气体氛围则根据细胞类型的不同而有所差异。
此外，细胞培养过程中还需要调节培养基的pH值，保持在细胞生长所需的合适范围内。
4. 细胞生长因子的添加：细胞培养过程中需要添加适当的生长因子和激素，以提供细胞生长所需要的信号和刺激。
例如，培养肿瘤细胞时可以添加生长因子如表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（aFGF）等，以促进细胞增殖和分化。
5. 细胞的传代和分化：为了维持细胞的生长和代谢活性，细胞在培养过程中需要定期进行传代。
细胞传代是指将细胞从一个培养皿中移植到新的培养皿中，保持细胞的生长状态。
此外，细胞在培养过程中还可以通过添加适当的诱导剂来进行分化，使细胞向特定的细胞类型发展。
总之，细胞培养的基本原理是通过提供适宜的细胞生长环境，包括培养基的制备、维持适宜的培养条件、添加必要的生长因子和激素等，使细胞能够在体外生长、分裂和分化，从而实现对细胞生长和发育的研究和应用。
细胞培养流程
细胞培养流程细胞培养是生物学实验中常见的一项技术，它可以帮助研究人员观察和研究细胞的生长、分化和代谢等生物学特性。
在进行细胞培养实验时，需要严格按照一定的流程和操作规范进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
下面将介绍一般的细胞培养流程，希望对初学者有所帮助。
1. 材料准备。
在进行细胞培养实验之前，首先要准备好所需的材料，包括培养基、培养皿、细胞传代液、无菌吸管、移液器、离心管等。
这些材料需要提前消毒和准备，以确保实验过程的无菌性和安全性。
2. 细胞解冻。
如果是从冻存状态的细胞开始培养，首先需要将细胞解冻。
解冻的过程需要在无菌工作台内进行，使用预先加热的培养基缓慢将细胞解冻，然后将细胞悬于完整培养基中。
3. 细胞传代。
一旦细胞达到一定的密度，就需要进行传代。
传代是指将已培养的细胞分离并重新接种到新的培养皿中，以保持细胞的活力和增殖。
在传代的过程中，需要注意细胞的数量和培养基的配比，以确保细胞的健康生长。
4. 观察细胞生长。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的生长情况。
通过显微镜观察细胞的形态、数量和活性，及时发现并处理细胞的异常情况，如细胞凋亡、感染等。
5. 细胞收获。
当细胞达到所需的数量和状态时，就需要进行细胞的收获。
收获细胞时，需要使用适当的酶溶解细胞，并进行离心等操作，最终获得细胞沉淀物。
6. 细胞冻存。
如果需要长期保存细胞，就需要进行细胞的冻存。
在冻存前，需要将细胞悬于含有冻存剂的培养基中，然后将细胞缓慢冷冻至液氮温度，以确保细胞的冻存质量。
以上就是一般的细胞培养流程，当然在实际操作中还会根据不同的细胞类型和实验目的进行一些细节上的调整。
希望初学者能够通过这些基本步骤，掌握细胞培养的基本技术，为日后的实验工作打下坚实的基础。
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显G带法 胰酶-Giemsa混合显带法:(1)预处理:中期染色体标 本,置60-80℃温箱20-30min，或在37℃温箱过夜; 然后浸入0.025M磷酸缓冲液中，Ph6.8 56℃温浴 10min; (2)消化和染色:用现配的胰蛋白酶-Giemsa混合液消 化和染色10-30min,混合液按如下比例配 制:0.025M磷酸缓冲液pH6.8 73ml,甲醇 27ml,Giemsa干粉50mg 0.25%胰酶0.3-0.4ml (3)封片:自来水冲洗，入蒸馏水漂洗数次、晾干、二 甲苯透明2-3分钟、封入中性树脂中;
BUdR掺入后细胞分裂周期的鉴别法：
染色体脆性位点的检测： 染色体臂上易发生断裂的特定部位称染色体脆性位 点(fra)近来研究证明fra与某些遗传病特别是癌症有 密切关系;在fra发生区多为癌基因存在部位。有家 庭遗传性癌症患者及成员fra的检出率比一般人高， 因此可作为易发癌症倾向的指标。检测仍可用末梢 血培养法，但用常规培养液培养时检出率较低。为 提高检出率，以下措施被证明能增加检出率: ①在培养时把血清量降到5%: ②用不含叶酸的MEM-Fra培养基培养。 ③PH调至7.5。
三、染色体结构显示和检测： 易着色的阳性带为含有A-T多的染色体节段;相反GC多的则不易着色,为阴性带,有报道已被定位的正常 基因和异常基因绝大部分都在阴性带区,人们推测,看 家基因可能多在阳性区带,组织特异基因在阴性区带, 人染色体能显现出近2000个G带,这些带再融合成一 般显微镜下可见的850条左右的带。
3.传代培养细胞染色体显示法 培养细胞:指数生长期,80%-90%汇合单层细胞; 加秋水仙素:终浓度为0.02-0.8µg/ml营养液;温箱继 续培养6-10h;或用低温封闭法:把培养细胞置于4℃条 件下6-12h,再于37℃温箱中继续培养6-10h; 采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着 不牢特点,令培养液在培养细胞表面反复冲涮,应用此 法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落; 离心:收集培养液,1000转/分钟离心5-10min; 低渗处理:吸除上清液,加入预温至37℃的0.075M KCl溶液,在温箱中静置20-30min;
碳酸复红显示X染色质法： 染色液:干液:碱性复红3g,溶100ml70%乙醇中,可保存 工作液:(现用现配)干液10ml;5%石碳酸水溶液90ml; 冰醋酸10ml;甲醛(40%)10ml 染色步骤:(1)细胞:BSS洗,染色5-10min,如用涂片应待 片干后,迅速投入96%酒精固定10-15min再染色; (2)分化:96%酒精分化1min,分化时要不断摇动; (3)脱水:通过纯酒精1分钟; (4)封片:二甲苯透明2-3min，树胶封固。 结果:细胞质不着色,细胞核染成紫红色,阳性Barr氏体 附于细胞核膜内面呈三角形或半月形小体。
5.羊水细胞培养 抽取羊水:无菌抽取羊水10-20ml,注入无菌离心管 中; 离心分离:1000转/分离心10min，去上清,留0.5ml; 培养:加培养液4m1(含小牛血清1ml)，用NaHCO3 调pH至6.8，在37℃温箱中培养7-10d后，可见大 量成纤维细胞或上皮样细胞生长。加秋水仙素0.020.8 µg/ml营养液，作用10-12h; 其余步骤与传代细胞培养染色体制备法相同。
预固定:向悬液中加新鲜醋酸/甲醇固定液1ml; 固定:离心,去上清,加固定剂5-10ml;置15-20 min; 重复一次, 去上清，余下固定液0.5-1ml; 制片:洗净载物片,预冷, 向片的一侧滴2-3滴细胞悬 液，滴片时的距离能保持半米高度。滴片后置室温 中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可; 染色和封片:一般常用Giemsa染色; 染色1O分钟后， 水洗、晾干、可直接观察(适用油浸镜);如标本需 要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中 性树胶封片(或先迅速过丙酮两次，每次30秒)后， 再过二甲笨，然后封片亦可。
BUdR掺入和制片程序: (1)BUdR培养液制备:先制备好含BUdR的培养液(最 终浓度为3-10µg/ml); (2)BUdR掺入:如用传代细胞，在末次传代后，改换 用含BUdR的培养液培养;如为人末梢血细胞，一开 始就用含BUdR培养液培养,温箱内避光培养; (3)中止掺入与制片:待细胞经历两个细胞周期(人周 围血细胞培养48或72h); (4)加秋水仙素,制片。
姐妹染色单体分化染色: 方法一、(1)老化:中期染色体标本老化1-2d; (2)预处理:放入85-89℃的1M NaH2PO4,溶液中 15min; (3)制片:用温蒸溜水轻轻漂洗,晾干,Giemsa液染色 10min,晾干,二甲苯透明,封固。 方法二、即FPG法(1)标本:掺入BUdR的中期染色体; (2)荧光染色:Hoechst33258染色12-15min; (3)黑光灯照射:自来水冲洗,加1滴pH8.0Sorensen缓 冲液,覆以盖片,黑光灯照射(2Ow),距离5cm,时间0.5h; (4)温浴:50-60℃2×SSC液温育2h，蒸馏水冲洗,晾干; (5)染色:pH6.8的2% Giermsa染色15分钟,透明封固。
阻抑中期分裂: 秋水仙素法:秋水仙素有特异抑制纺锤丝蛋白合成作 用，能阻抑分裂中期活动，而对DNA作用较小，借 此可截获很多中期分裂相，产生类似提高分裂指数 的效应。该药有强烈的毒性，用量过大或作用时间 过长，可使染色体缩短和发生异常分裂现象。 低温处理:把指数生长期细胞放置到室温或冰箱中 4℃4-12h，因温度降低时DNA合成受抑制，细胞 不进入分裂期，当恢复用37℃温箱培养并用秋水仙 素后，会出现代偿性分裂高潮，也产生提高分裂相 数效应。
4.人末梢血微量全血培养染色体显示法： 显示人染色体过去主要取骨髓培养,利用其中干细胞 能进行增殖显示染色体,末梢血淋巴细胞是已发生分 化,处于功能态和无分裂活动细胞,但在PHA的诱导 下,T淋巴细胞重新进入增殖态发生细胞分裂,为获得 淋巴细胞可用多量血分离和微量全血培养两种方法。 培养液准备:取15ml培养瓶数个,每瓶内分别含青霉 素100单位,链霉素100µg/ml,PHA0.1ml,培养液共 5ml 抽血针管准备:取2-5ml针管一支，肝素润洗针管；
Giemsa显带法:(1)预处理:将标本置入60-80℃温箱 或烤箱中20-30min;亦可在37℃温箱中过夜; (2)胰酶消化:0.85%的NaCl配制0.25%胰蛋白酶溶液 消化3-5min; (3)染色:先吸除多余胰酶液,置Giemsa染液中10min; (4)封片:自来水洗,蒸馏水洗,晾干,二甲苯透明2-3min, 封入中性树胶中。 注意:胰酶消化是重要的环节,消化不足带不出现,消化 过度,染色体变得膨胀和不着色,必须把握好胰酶浓度 和消化持续时间,预处理或老化是显带过程中另一个 重要环节,对消化和染色有很大影响。
1.染色体显带方法要点 分带种类:
Q带:用奎吖因(QM)和阿的平(QD)荧光染色的带， 称“Q”带; G带:用Giemsa染色显带称“G带”; C带:用Giemsa染色显示异染色质部分称“C”带; R带:显现出与Q带和G带相反的带型称“R”带等 中期染色体: 染色体质量好的标准是:①长度适宜，一般要稍长一 些，能显出更多的带来; ②染色体分散均匀无重叠 现象，此与低渗有密切关系; ③无严重，立即显带时效果不理想。 一般要经过三个步骤:①先放置一段时间即所谓“老 化”，老化时间以3-l0d为宜;②在显带染色之前， 对染色体标本能进行预处理，常用的办法是加温， 利于显出带来;标本做预处理后可不必再老化。我国 很多研究室工作证明，干热加温做预处理效果很好 (80℃干热20-30min);③用胰蛋白酶消化、NaOH , 尿素、无机盐等化学试剂处理，其中以胰蛋白酶消 化较好。
2.促染色体分散措施： 低渗处理:应用低渗盐溶液处理,可使细胞体积胀大、 染色体松散，便于制备染色体标本。低渗可用蒸馏 水、1%枸椽酸钠、加水稀释培养液(1:3),0.075M KC1等方法。目前最多用的是0.075M的KC1,在 37℃水浴中作用20-40min，效果最好。 醋酸固定:大多数固定剂都使组织细胞收缩，而醋酸 却有膨胀固定作用，和醇类混合固定有利于染色体 松散效应。现多应用醋酸/甲醇混合液固定，用时宜 现用现配。
3.姐妹染色单体分化染色 细胞被培养在含有BUdR培养基中,在DNA合成 时,BUdR作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶核苷被掺入 到新合成的DNA中,在第一个细胞周期,由于半保留复 制,中期染色体的每条染色单体DNA双链都被掺入了 BUdR(TB·TB)。在第二个周期时,中期两条染色单体 中只有一条单体保留了半数无BUdR的旧链,而另一条 单体的双链都含有BUdR(TB·BB),33258染色时,TB 链能发出较强荧光,BB链对荧光有淬灭作用发弱光。 永久标本法:热磷酸盐处理加Giemsa染色和荧光染料 加Giemsa染色(FPG),TB链与Giemsa染料亲和力强， 与BB链亲和力差。
2.常用染色体显带方法: 显Q带法:(1)漂洗:取经过干热预处理或已老化的染 色体标本,置入pH6.0缓冲液中浸5-10min; (2)染色:浸入pH6.0的QM或QD染液中5-10min; (3)漂洗:浸入新鲜pH6.0缓冲液中洗2次,每次5min; (4)观察:向标本染色体面滴1-2滴新鲜缓冲液,覆以 盖片(避免出气泡),置荧光显微镜下观察。 注意事项:观察期间,要随时滴加缓冲液,以防蒸发于 涸后荧光减弱;染色后标本应充分漂洗,避免残留荧光 染液,否则背底将发荧光影响观察,标本如因染色不足 发光较弱,可揭去盖片重染。
组织和细胞培养
郎朗
第九章 细胞遗传学性状检测
一、性染色质检测 女性的两个X染色体中的一个,间期染色质呈异固缩,呈 深染的小体称Barr氏体。Barr氏体位于间期细胞核内 面,呈三角形或半月形小体,易为碳酸复红或硫堇等染 料着色,正常女性Barr氏体阳性,男性为阴性,男性Y染 色质位于间期细胞核近中央部,易为盐酸阿的平着色, 荧光显微镜下观察发较强荧光,呈点状小体,发光部分 系Y染色体异固缩的长臂,初代培养细胞和二倍体细胞 株均可观察到性染色质,传代细胞系表现不规律。
荧光染色显示Y染色质法： 荧光染液：PBS100ml；盐酸阿的平0.2g 染色:Y染色质显示染色与染色体荧光显带法相同。 结果:在荧光显微镜下观察,Y染色质呈特别明亮黄绿 色荧光圆点,直径0.25-0.3微米,可位于核内任何位 置,但以近中央时居多。