细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
细胞培养（hela, 293,239T等细胞的培养）Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
细胞培养
293FT
293T
HSF-6
2.原代细胞 HDF：Human dermal fibroblasts 表皮细胞 羊水细胞 尿液来源的肾小管上皮细胞 MEF：mouse embryonic fibroblasts 大鼠皮层神经元
HDF 3.细胞株 淋巴细胞株
肾小管上皮细胞
羊水细胞
细胞培养基础知识
一.无菌操作
1.层流级别（洁净级）
洁净空间单位体积空气中，以大于或等于被考虑直径的粒子 最大浓度限值进行划分的等级标准。
2.消毒和灭菌
二.细胞培养条件
பைடு நூலகம்
温度：37℃ CO2浓度：5% pH:7.2---7.6 湿度：100% 渗透压
三.细胞培养基
• 基础培养基：细胞生长的基础物质，水分，pH/渗透压缓冲液等 DMEM、RPMI-1640、DMEM/F12 • 血清：必须的、未知的微量营养物质或生长因子等 FBS、HBS • 非必须氨基酸：NEAA • L-谷氨酰胺、双抗等等
4. DMSO（二甲基亚砜）
是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低 冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形 成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
5. 细胞的冻存与复苏—缓冻速溶原则
当细胞冷冻到0℃以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升 高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的 冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快 融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
6.血细胞计数板
7.细胞培养中各类污染的辨别
8.避免不同细胞间的交叉污染同样非常重要
细胞生物学实验Hela细胞培养
培养基
培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，包括天然培养基和合成 培养基。 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好。 缺点：来源受限，成分复杂，存在批次的差异，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，容易发生支原体污染。 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模 拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其 它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
潜伏期：
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行 实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
细胞生物学实验Hela细胞培养
新传代的NRK细胞（大鼠肾细胞） 传代后24小时
对数生长期的NRK细胞 传代后三天
早平台期的NRK细胞 传代后7天
细胞生物学实验Hela细胞培养
贴附生长细胞的生长过程
106
细胞数/毫升
无限细胞系
105
有限细胞系
接种培养
104
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
天
潜伏期
指数增生期
平台期
细胞生物学实验Hela细胞培养
培养细胞生长的条件
细胞生物学实验Hela细胞培养
CLASS II 细胞生物学实验Hela细胞培养
293T 细胞培养
精心整理293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。
在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。
6～8h后待细胞贴壁更换培养基。
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。
293细胞培养基本技术实践(细胞培养传代计数与冻存)
美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC） 和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞 库（CAR）等，其中 ATCC不仅是美国也世界最 大的细胞库。ATCC也是世界卫生组织WHO的国 际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200 个已经过鉴定的细胞系，其中包括来自正常人和 各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物 种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界 各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各 国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈 利性研究时收费）。
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
细胞培养方式
群体培养（mass culture），将含有一定数量细 胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合 后形成均匀的单细胞层 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离 细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此 距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细 胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中 的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器
简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳， 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降 1 ～ 2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液 氮中。
预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称 和冷冻日期。
293t细胞培养说明书
293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。
因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。
二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。
2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。
3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。
4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。
5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。
三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。
四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。
在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
293细胞培养
比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细 胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生 存的基本条件。
2、上皮型细胞 此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核， 细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组 织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。 3、游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的 游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一 定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊 水细胞培养的早期。 五、培养细胞形态分析 培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一 般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有 1-2 个核仁在细胞 机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表 明细胞代谢不良。
293 细胞的大规模培养
293 细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门 载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传 疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞 293 中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸 激酶 1C 等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善 293 细胞的大规模培养技术具有越来 越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬 浮培养。这三种方式均可用于 293 细胞的大规模培养。
HEK293T细胞培养
细胞系的第一步。
细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到
另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消
化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染
梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲
霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色
漂浮物。
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测
镜检有丝状物
细胞污染问题与解决方案
常见的真菌污染
HEK293细胞的复苏
复苏前的准备
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下
将水浴锅预热至37℃
取新培养瓶（75cm2），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM培
养基(37℃预热)，润湿底面
HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化
服传出细胞间外。
进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关 闭状态。
LOGO
细胞间的操作注意事项
操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。
试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。
实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、 关闭风机。 凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75% 酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台 使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。 每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入 放入培养箱中继续培养。
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Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
镜下观察，摇匀，放入37度孵育。
收超净台。
293T细胞培养条件：37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。
细胞相关操作：细胞复苏1.37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）；2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
细胞传代1. 当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；2. 37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）；3. 在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；4. 显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（DMEM+10% FBS）终止消化；5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；8.将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养。
细胞冻存1.37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）；2.消化细胞后给细胞计数:1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2；这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。
5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。
注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。
3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。
4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。
5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-3×106/ml。
6.将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。
7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，-20°C放1-2h后，-80°C过夜，然后快速转移到液氮中。
293细胞培养293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。
细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。
刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。
复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。
换液前宜将培养基预热。
5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。
其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
5、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。
这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。
如果是新的塑料培养瓶就不用处理。
培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3配置高糖的DMEM培养基1000ml，1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解2.加入NaHCO3 2.0g3.加入谷氨酰胺 0.146g（终浓度为5mM）4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml）5.定容900ml6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中7.加入灭活小牛血清100ml。
Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞），是一种悬浮细胞。
我的经验如下：1、培养液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，庆大霉素100IU／ml；2、培养条件：5％CO2，37度，30％湿度；3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml 左右的培养液，800～1000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加入新的培养基就可以进行培养了；4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以3～4天传一代，传过两代后，一般2～3天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。
5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15％DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃1小时）→液氮。
培养经验细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml的加样器在超净台，没有拿出来过，我想这样也许会减少污染；（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15％的小牛血清，但细胞总是长不好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20％，细胞生长旺盛；（4）HEPES虽然贵点，但加上去后细胞会长的不错；（5）在超净台操作前要用0.1％的新洁尔灭或75%酒精擦手。
1.AsPC-1（转移胰腺腺癌细胞）【细胞复苏的方法】:（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～42℃水浴中，晃动，使其尽快融化（1分钟左右）。
（2）用培养液稀释至原体积的10倍以上，直接培养。
（3）或低速离心，去上清，加新鲜培养液培养。
SK-OV-3 [SKOV-3]细胞，人卵巢癌细胞细胞(株)KM12人结肠癌细胞。