293细胞复苏传代冻存
293T细胞培养攻略
293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。
在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。
2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。
当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。
首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。
溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。
将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。
3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。
细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。
293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。
在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。
5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。
为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。
然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。
将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。
将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。
总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。
通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。
有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。
293T细胞的培养[1]
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293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
293t细胞冻存步骤
293T细胞是一种广泛应用于细胞生物学和分子生物学研究中的细胞系，冻存293T细胞的 步骤如下：
1. 细胞培养：将293T细胞在含有适当培养基（如DMEM）和10%胎牛血清（FBS）的细 胞培养皿中培养。细胞应保持在37℃、5% CO2的培养箱中，并定期更换培养基。
2. 细胞准备：当293T细胞生长至80%-90%的密度时，准备细胞用于冻存。将细胞从培养 皿中用胰酶或三胰蛋白酶等酶解剂进行胶原酶消化，使细胞分散成单细胞悬浮液。
3. 细胞计数：使用细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，以确定细胞的浓度。
293t细胞冻存步骤
4. 细胞冻存液的配制：根据细胞密度计算所需的冻存液量。常用的冻存液配方包括含有 10% DMSO（二甲基亚砜）的培养基。将DMSO缓慢加入到培养基中，充分混合。
5. 细胞冻存：将细胞悬浮液冻存液按照适当比例混合，使细胞最终的浓度为1-2×10^6 细胞/mL。将混合液分装到冻存管中，每管约放入1-2 mL的混合液。然后将冻存管放入冷冻 容器中，以-80℃或液氮中的-196℃进行冷冻。
6. 细胞保存：将冻存管转移到液氮罐中进行长期保存。细胞在液氮中保存时可以长期保持 其生物学特性。
293t细胞冻存步骤
需要注意的是，在进行细胞冻存时，应注意细胞的健康状态、冻存液的配制和细胞密度的 控制，以确保冻存后的细胞能够保持其生物学特性和可用性。
293e细胞培养方法
293e细胞培养方法
一、细胞株选择
293e细胞株是一种常用于病毒包装和基因表达研究的人肾上皮细胞株。
选择健康、活力好的293e细胞株是培养成功的关键。
二、培养基和添加剂
293e细胞适宜在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM培养基中生长。
根据细胞生长状况，可适当调整血清浓度和谷氨酰胺的用量。
三、传代和扩增
当细胞密度达到80%以上时，可进行传代和扩增。
传代时，将细胞悬液以1:3的比例传至新的培养瓶中。
扩增时，将细胞悬液接种到多孔板或液滴中，以实现细胞的规模化培养。
四、细胞鉴定
通过形态观察、免疫荧光染色等方法对293e细胞进行鉴定，确保细胞的纯度和特性。
五、培养条件控制
保持培养室内温度为37℃，湿度为5% CO2。
定期更换培养基，并根据细胞生长状况调整培养条件，如温度、湿度、CO2浓度等。
六、细胞冻存与复苏
为保证细胞的长期保存和快速复苏，可以采用细胞冻存技术。
将细胞悬液与冷冻保护剂混合后，迅速冷冻并保存在-80℃冰箱中。
复苏时，将细胞悬液快速融化并接种到新的培养瓶中。
七、细胞污染防控
为防止细胞污染，需严格控制培养环境，定期对培养基、添加剂和细胞进行无菌检测。
如发现污染，应立即停止培养并采取相应措施。
八、细胞凋亡检测
采用流式细胞术、荧光染色等方法对293e细胞的凋亡情况进行检测，以了解细胞的生长状况和死亡情况。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
293细胞培养基本技术实践(细胞培养传代计数与冻存)
美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC） 和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞 库（CAR）等，其中 ATCC不仅是美国也世界最 大的细胞库。ATCC也是世界卫生组织WHO的国 际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200 个已经过鉴定的细胞系，其中包括来自正常人和 各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物 种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界 各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各 国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈 利性研究时收费）。
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
细胞培养方式
群体培养（mass culture），将含有一定数量细 胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合 后形成均匀的单细胞层 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离 细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此 距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细 胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中 的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器
简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳， 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降 1 ～ 2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液 氮中。
预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称 和冷冻日期。
293细胞培养
293细胞培养1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：（1）37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3. 传代吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。
我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
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复苏293细胞
1.紫外消毒超净台，完全培养基（10％FBS）复温，准备一个15ml离心管；
2.从液氮（-198℃）中取出293细胞，在37℃水浴锅解冻；
3.取10ml完全培养基于15ml离心管，加1.5ml冻存293细胞，轻轻混匀；
4.离心1500rpm，3min；
5.吸走上清，混匀后加5ml完全培养基；
6.吹打混匀后转入培养瓶培养。
293细胞传代
1.293细胞长到70％即可传代，将培养皿边缘用酒精棉球擦一遍；
2.负压吸走培养基，加PBS 洗一遍；
3.负压吸走PBS，加胰酶（没过皿底即可）消化；
4.负压吸走胰酶，加两吸管培养基，将细胞从皿底吹落；
5.对准皿底用力吹打10下，将细胞吹散；
6.将吹散细胞加入培养基内，摇匀；
7.种细胞，6孔板每孔加2ml（用于转染的板需先用Polylysine扩板），放回孵
箱培养。
冻存293细胞
1.当293细胞长到70％时，准备冻存；
2.冻存液：90％完全培养基，10％DMSO （根据说明书要求配制，不同种类
293冻存液不同）；
3.吸干培养基，用PBS洗一遍；
4.加入胰酶消化后，吸去胰酶，加入少许培养基吹打；
5.转入15ml离心管，加培养基至10ml并混匀；
6.离心1500rpm，3min；
7.吸去上清，沉淀加冻存液吹打混匀（根据要冻存的细胞的多少加适当量的冻
存液，冻存细胞浓度不宜过稀，一个25cm2培养瓶冻2-3管）；
8.分装至冻存管，每管约1.5ml；
9.将冻存管放入异丙醇盒并置于-80℃过夜;
10.然后将冻存管放入液氮储存。